Dalla teoria alla pratica:

Transcript

1 Università degli Studi di Napoli Federico II Facoltà di Scienze MM. FF. NN. Dalla teoria alla pratica: Acquisizione di conoscenze di base teoriche e pratiche per la titolazione di ormoni o marcatori molecolari, mediante ELISA Dott.ssa Luisa Cigliano Dipartimento di Biologia luisa.cigliano@unina.it

2 Tecnica ELISA per il dosaggio di marcatori molecolari Obiettivo dell esercitazione di Fisiologia: Apprendere come utilizzare la tecnica ELISA Metodologia: Effettuare un esperimento ELISA, analizzare i risultati ed interpretare i dati Verifica: corrispondenza tra la quantita attesa e quella calcolata.

3 L ELISA unisce la specificità degli anticorpi con la sensibilità di semplici dosaggi spettrofotometrici di un enzima mediante l uso di anticorpi (Ab) o antigeni (Ag) uniti ad un enzima dosabile e con un alto numero di turn over.

4 Sostanze rivelabili mediante ELISA Ormoni proteici (ossitocina, insulina, glucagone) Ormoni steroidei (estradiolo, progesterone, testosterone) Ormoni amminoacidici (tiroxina, adrenalina, noradrenalina). Marcatori tumorali, mediatori di infiammazione, citochine, piccoli peptidi. Glicoproteine etc etc L Elisa viene anche utilizzata per il dosaggio di: fattori ematici, markers tumorali, estrogeni, ormoni, rivelazione di tossine batteriche, Candida Albicans, Herpes simplex virus, antigene di superficie dell epatite B, per titolare anticorpi contro virus (Brucella, Salmonella), contro funghi (Candida, Aspergillus), contro parassiti, auto-anticorpi etc etc etc

5 REAZIONI SIEROLOGICHE Reazioni con formazione di un immunocomplesso Antigene noto: determinare presenza anticorpo nel siero Anticorpo noto: determinare presenza antigene nel siero COME EVIDENZIARE E QUANTIFICARE LA FORMAZIONE DELL IMMUNOCOMPLESSO?

6 TECNICHE IMMUNOCHIMICHE Dosaggio Radioimmunologico Competitivo (RIA) Applicazioni: Ormoni (TSH, FSH, LH), Steroidi, farmaci Enzyme linked Immunosorbent Assay (ELISA) Applicazioni: insulina, estrogeni, gonadotropina corionica ecc. Dosaggi immunologici mediante fluorescenza (FIA) Applicazioni: tiroxina, testosterone, progesterone, estradiolo, cortisolo.

7 Classi principali di risposte immunitarie adattative

8 STRUTTURA DI UNA MOLECOLA DI IgG

9 CARATTERISTICHE DELL INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO Reazione molecolare reversibile con formazione di legami deboli: Forze di Van der Waals Ponti idrogeno Attrazione elettrostatiche Aggregazione delle regioni idrofobiche Affinità Alta specificità di reazione: dipende da stretta complementarietà tridimensionale

10 Anticorpi policlonali: anticorpi reattivi contro più di un epitopo dello stesso antigene e per questo multispecifici). Anticorpi monoclonali: Anticorpo secreto da un clone di ibridoma. Poiché ciascun clone è derivato da una singola cellula B, tutte le molecole anticorpali prodotte sono identiche. Per anticorpi monoclonali si intende una popolazione omogenea di anticorpi prodotti da un clone cellulare (ibridoma) ottenuto per fusione di: a) cellule immunoproduttrici con b) cellule di mieloma maligno, dotate di specificità verso un solo epitopo dell antigene immunizzante.

11 Anticorpi policlonali La fase preliminare e la produzione di anticorpi (Ab) verso una determinata proteina antigene (Ag). Occorrera : 1) Purificare la proteina per non produrre Ab verso contaminanti. 2) Scegliere l animale adatto, usualmente il coniglio 3) Scegliere un opportuno adiuvante per stimolare il sistema immunitario dell animale 4) Iniettare la proteina antigene (0.5-1 mg per il coniglio) con l adiuvante per 3-4 volte a distanza di 2-6 settimane ogni volta. 5) Raccogliere il sangue e separare il siero. 6) Eventualmente purificare la frazione anticorpale con precipitazione in solfato d ammonio al 40-50%, seguita da cromatografia a scambio ionico.

12 Preparazione di ibridomi che secernono Anticorpi monoclonali contro un antigene particolare

13 CLASSIFICAZIONE DOSAGGI ORMONALI In base alla caratteristica del metodo: competitivi non competitivi In base al tipo di marcatura: marcatura con radioisotopi marcatura con enzimi: substrato cromogeno substrato flurogeno Sostanze chemioluminescenti Rilevatore segnale - contatore di radiattività - spettrofotometro - fluorimetro - Fotorilevatore

14 A ,35 0,062 0,368 0,071 0, ,35 0,062 0,368 0,071 0,435 B ,442 0,07 0,459 0,085 0, ,442 0,07 0,459 0,085 0,545 C 0,388 0,348 0,539 0,458 0,836 0,501 0,388 0,348 0,539 0,458 0,836 0,501 D 0,565 0,514 0,436 0,627 0,691 0,575 0,565 0,514 0,436 0,627 0,691 0,575 E 0,437 1,258 0,619 1,073 1,088 1,138 0,437 1,258 0,619 1,073 1,088 1,138 F 0,435 1,262 0,814 1,377 0,787 1,539 0,435 1,262 0,814 1,377 0,787 1,539 G 0,339 0,841 0,689 0,903 0,738 1,189 0,339 0,841 0,689 0,903 0,738 1,189 H 0,308 1,061 0,824 1,094 0,578 0,804 0,308 1,061 0,824 1,094 0,578 0,804

15 DIRETTO INDIRETTO CATTURA ANTIGENE SANDWICH

16 I vari passaggi in ELISA Per Per Per Per 1) (fase di COATING) Immissione di ApoAI o altra proteina o campione biologico all interno dei pozzetti. 2)BSA (fase di BLOCKING) 3) Ab I anticorpo anti ApoA-I perox 4) Ab II anti-anticorpo coniugato a perossidasi 5) Fase di sviluppo: aggiunta di substrato e H 2 O 2

17 Enzima Fonte Reazione catalizzata Perossidasi Fosfatasi alcalina β- Galattosidasi Glucosio ossidasi Ureasi Rafano Intestino di vitello E.Coli Aspergillus niger Canavalia ensiformis H 2 O 2 +substrato ossidabile prodotto ossidato + 2 H 2 O R-O-P + H 2 O R-OH + Pi monoestere alcol fosfato ortofosforico inorganico β-galattoside + H 2 O galattosio + alcol β-glucosio+o 2 H 2 O 2 + acido gluconico (NH 2 ) 2 CO + 3H 2 O CO 2 + 2NH 4 OH

18 COMPLESSO ANTICORPO-ENZIMA ANTICORPO molto reattivo nei confronti dell enzima ENZIMA dotato di un elevato numero di turnover: fosfatasi alcalina perossidasi di rafano SUBSTRATI ENZIMATICI - la fosfatasi alcalina converte il p-nitrofenilfosfato a p-nitrofenolo giallo - Per la perossidasi di rafano si possono usare: * 3,3 5,5 -tetrametilbenzidina (TMB) (sviluppa un colore blu) * o-fenilenediamina (OPD) (sviluppa colore arancio)

19 Metodo indiretto

20 Metodo del doppio anticorpo

21 FASE SOLIDA: provette polipropilene piastre di microtitolazione di polistirene L antigene o l anticorpo vengono legati per: adsorbimento passivo attacco covalente con bromuro di cianogeno

22

23 Aterosclerosi

24 Aterosclerosi 1. disfunzione endoteliale 2. accumulo e modificazione delle LDL nell intima 3. migrazione di monociti e linfociti T nell intima 4. formazione delle foam cell 5. secrezione di citochine e di fattori di crescita da parte dei macrofagi

25

26 COLESTEROLO Origine: alimentare sintesi de novo: fegato, intestino Precursore di: - sali biliari, - ormoni steroidei, - vitamina D Funzioni: Costituente essenziale delle membrane plasmatiche Lipoproteine a bassa densità (LDL): colesterolo cattivo Lipoproteine ad alta densità (HDL): colesterolo buono

27 Trasporto inverso del colesterolo HDL HDL CE LCAT C C C C C C C CE LDL

28 ApoA-I Proteina antiaterogenica Promuove l efflusso di colesterolo Attiva enzimi importanti per il trasporto inverso del colesterolo.

29 Analisi dei risultati, dopo aver concluso l ELISA ApoA-I (ng/ml) Abs (492 nm) Campione Sign.Rossi: Abs = 0.52 Abs 492 nm y = x R 2 = ApoA-I (ng/ul) La quantificazione della concentrazione di proteina nei campioni di siero viene effettuata confrontando l Abs dei pozzetti contenenti il siero con quella dei pozzetti contenenti le soluzioni a concentrazione nota di ApoA-I. Infatti, riportando in grafico la media dell Abs delle soluzioni a concentrazione nota di ApoA1 in funzione della concentrazione stessa dell apolipoproteina si ottiene una retta di calibrazione mediante la quale è possibile determinare la concentrazione di ApoA1 nei campioni di siero analizzati, di cui è nota solo l Abs.