La reazione antigeneanticorpo

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1 La reazione antigeneanticorpo Natura della reazione FIGURE Four types of non-covalent forces operates over a very short distance ( generally 1 angstrom ) - The interaction depends on a very close fit between the & Ag. Legami non covalenti Legami idrogeno Legami elettrostatici Forze di Van der Waal Legami idrofobici Legami multipli Reversibilità 1

2 Affinità Forza della reazione tra un singolo determinante antigene e un singolo sito di legame sull anticorpo Calcolo dell affinità Alta affinità Bassa affinità Ag + Ag- Ag Ag affinità = bilancio tra forze attrattive e repulsive Applicando la Legge di Azione di Massa: [Ag-] K eq = [Ag] x [] Avidità Forza complessiva del legame tra un Ag con più determinanti e s multivalenti Specificità Capacità di un sito di legame dell anticorpo di reagire con un solo determinante antigene Capacità di una popolazione di molecole anticorpali di reagire con un solo antigene K eq = 10 4 Affinità 10 6 Avidità Avidità 2

3 Cross Reattività Capacità di un sito di legame dell anticorpo di reagire con più di un determinante antigene Capacità di una popolazione di molecole anticorpali di reagire con più di un antigene Reazioni Crociate Anti-A Anti-A Anti-A Ag A Ag B Shared epitope Ag C Similar epitope Reazioni sierologiche Grande varietà Precipitazione Agglutinazione Fissazione del complemento Reazioni immunoenzimatiche.. Diverse caratteristiche operative Sensibilità analitica Sensibilità e specificità diagnostiche Costo Complessità esecutiva Automatizzabilità.. Reazione di precipitazione totale Antigeni solubili Precipitato visibile ad occhio nudo Complessi antigene-anticorpo 3

4 Il reticolo di Marrack Reazioni di precipitazione in gel Immunodiffusione radiale doppia Immunodiffusione radiale 4

5 Precipitazione: immunoelettroforesi Reazione di agglutinazione per antigeni corpuscolati (batteri, globuli rossi) Le particelle dopo la reazione con gli anticorpi specifici si riuniscono in ammassi voluminosi visibili ad occhio nudo che tendono a sedimentare sul fondo della provetta Agglutinazione Agglutinazione su vetrino Determinazione dei gruppi sanguigni AB0 Identificazione di specie o di sierotipo di isolati microbici Ricerca di anticorpi a scopo diagnostico Reazione di Paul Bunnel per mononucleosi Agglutinazione in provetta Sierodiagnosi classiche: Widal (tifo e paratifi), Wright (brucellosi), Wei-Felix (rickettsiosi),. 5

6 4. Agglutination Reactions -visible clumping by interaction between & a particulate antigen suchas RBC, latex beads. -depend on the crosslinking of polyvalent antigens, similar to precipitation rxns (lgm is a good agglutinin) -provide a way to type bacteria with a panel of typing antisera. -routinely performed to type RBCs for blood transfusion (control) FIGURE 6-7 Demonstration of humaglutination using against sheep red blood cells (SRBCs): a constant # of SRBCs plus serial two-fold dilutions of anti-srbc serum 6

7 Immunofluorescenza indiretta diretta Immunofluorescenza 9. Immunofluorescence Fluorochromes -Fluorescein ( nm) -Rhodamine ( nm) -Phycoerythrin : absorb light of one wavelength & emit fluorescence at a longer wavelength than fluorescein. FIGURE 6-14 migm-producing B cells indirectly stained with rhodamine-conjurated secondary under a fluorescence microscope. 7

8 Metodi immunoenzimatici Enzyme linked immunabsorbant assay (ELISA) Sample to be tested Enzyme -> colour virus Detecting antibody Capturing antibody to detect (HIV, HCV) 6. ELISA ELISA for HIV antibody to detect Ag to detect Ag FIGURE 6-10 Variations in the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique, similar to RIA except using an Enzyme (alkaline, horseradish peroxidase, & β-galactosidase) : safer & less costly. Microplate ELISA for HIV antibody: coloured wells indicate reactivity 8

9 Sensitivity of various immunoassays Western Blot HIV-1 Western Blot Lane1: Positive Control Lane 2: Negative Control Sample A: Negative Sample B: Indeterminate Sample C: Positive 9