APPLICAZIONI DELLA CITOFLUORIMETRIA QUALCHE ESEMPIO

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1 APPLICAZIONI DELLA CITOFLUORIMETRIA QUALCHE ESEMPIO

2 STUDIO DEL SISTEMA IMMUNITARIO Una delle maggiori applicazioni della citofluorimetria e rappresentata dall analisi (e sorting) delle diverse popolazioni di cellule del sangue. Si sfruttano fondamentalmente due caratteristiche : 25 la maggior parte delle cellule del sangue mostrano distinti profili di forward and side scatter SSC-H: SSC-Height 2 5 granulociti monociti 5 linfociti FSC-H: FSC-Height le diverse popolazioni cellulari esprimono sulla propria superficie markers specifici che le discriminano dalle altre

3 GATING E SORTING L analisi multiparametrica, uno dei piu potenti aspetti della citofluorimetria a flusso, permette di affrontare i problemi biologici della eterogeneita cellulare. Sfrutta due operazioni fondamentali della CFM: il gating e il sorting. Gating: utilizzando una finestra elettronica, permette di isolare una determinata popolazione da tutte le altre cellule, e di analizzare i parametri successivi solo all interno della popolazione ghettata, dividendola cosi in ulteriori subpopolazioni. Sorting: e un gating reale, che consente di raccogliere fisicamente le popolazioni che sono state separate dal resto della miscela. Si stabiliscono delle finestre di selezione per identificare le popolazioni di interesse che verranno separate e raccolte in provette distinte. Le cellule mantengono la vitalita dopo il sorting!!! Citofluorimetri a circuito chiuso: il campione analizzato viene perso Citofluorimetri a circuito aperto: il campione incontra il fascio di luce laser in aria, per poi essere recuperato selettivamente dopo il sorting.

4 IL SORTING Il termine sorting indica la capacità di un citofluorimetro (FACS), di raccogliere fisicamente le sottopopolazioni cellulari separate dalla popolazione eterogenea iniziale in base alla diversa espressione antigenica. Il campione fluido viene frammentato in minuscole goccioline, ognuna delle quali contiene una singola cellula. Le goccioline vengono caricate elettricamente e deviate mediante piastre di deflessione negli appositi raccoglitori. Al termine del sorting le cellule mantengono la vitalità.

5 Strategie di gating: Situazione ideale (fortunatamente abbastanza tipica): le cellule positive per il marcatore sono ben separate da quelle negative, rientrando quindi in una finestra ben definita. Parziale sovrapposizione della fluorescenza tra cellule positive e negative per il marcatore Picco unimodale di fluorescenza, in cui l istogramma delle cellule positive presenta un leggero shift rispetto alle cellule non marcate

6 Strategie di Gating 25 2 SSC-Height FSC-Height CD4 PerCP Altri markers CD8 FITC CD4 PerCP CD4 PerCP Altri markers CD8 FITC CD8 FITC

7 Strategie di Gating SSC-Height # Cells CD8 PerCP CD8 PerCP CD28 PE CD28 PE 25 SSC-Height # Cells CD4 PerCP CD4 PerCP CD28 PE CD28 PE

8 Analisi multiparametrica L analisi multiparametrica e uno dei piu potenti aspetti della citofluorimetria a flusso, che sfrutta la strategia di gating. E ampiamente utilizzata per caratterizzare fenotipicamente diverse popolazioni cellulari. Con i moderni citofluorimetri si possono utilizzare 4 (e piu ) colori contemporaneamente!!! Flow cytometric panel: FITC PE PerCp APC Cyclin B CD25 CD69 CD8 Cyclin B CD28 CD95 CD8 Cyclin B CD62L CD45RA CD8 Cyclin B CD25 CD69 CD4 Cyclin B CD28 CD95 CD4 Cyclin B CD62L CD45RA CD4 Cyclin B CD4 DR CD8 Cyclin B CD6 CD2 CD3 CD28 CD62L

9 Strategia di gate per analisi multiparametriche CD8 Cyclin B CD8+ Cyclin B- CD8+ Cyclin B+ 5 8 CD8 HLA-DR

10 ANALISI DEL CICLO CELLULARE Nelle cellule dei tumori (soprattutto solidi) e spesso riscontrabile una variazione nel contenuto di DNA, principale conseguenza di mutamenti genetici cromosomici e subcromosomici, aventi un ruolo fondamentale per lo sviluppo e il decorso della malattia. Una delle prime applicazioni della citofluorimetria e stata proprio l analisi della posizione nel ciclo cellulare, effettuata tramite quantificazione del DNA cellulare. La citofluorimetria e ancora oggi la tecnica piu utilizzata per una veloce ed accurata determinazione della distribuzione delle cellule nelle varie fasi del ciclo cellulare.

11 ANALISI DEL CICLO CELLULARE Nel metodo piu semplice, il contenuto di DNA e rilevato usando un colorante fluorescente in grado di legare il DNA con alta affinita. Propidium iodide: e il colorante piu comunemente utilizzato. Dopo essersi legato al DNA, aumenta notevolmente la propria fluorescenza. Richiede la permeabilizzazione delle membrana plasmatica. Hoechst 33342: e meno utilizzato, ma rappresenta una valida alternativa quando e richiesto la colorazione di cellule non permeabilizzate (vive).

12 ANALISI DEL CICLO CELLULARE Quando la quantita di DNA viene misurata su cellule non sincronizzate, si osservano cellule con quantita di DNA variabile da 2N (G/G) a 4N (G2/M). Un istogramma rivela la frazione di cellule presente nelle varie fasi del ciclo cellulare

13 ANALISI DEL CICLO CELLULARE Il monitoraggio della proliferazione cellulare e posizione in ciclo per mezzo della misurazione del DNA quale singolo parametro pone diverse limitazioni: non permette di distinguere cellule in G da quelle in G (stesso contenuto di DNA) non permette di distinguere cellule in G2 da quelle in M, (stesso contenuto di DNA); totale mancanza di informazioni circa la cinetica cellulare. Analisi Multiparametrica: Assieme al contenuto di DNA vengono valutati altri parametri della cellula strettamente correlati alla sua posizione nel ciclo. L analisi multiparametrica e diventata il metodo preferenziale per studiare le connessioni tra la progressione nelle varie fasi del ciclo di una cellula e la sua crescita (es contenuto di RNA, specifiche proteine), attivazione (es specifici markers di superficie), proliferazione (es Ki67, specifiche cicline) e differenziazione (es specifici markers tumorali)

14 Aumentato Turnover delle cellule T in pazienti infetti da HIV Controls (4.2) 2. HIV (.8) HIV + HAART (34.7) 2.5 CD4 (2).2 (59.).4 (43.7).5 CD8 KI67

15 Valutazione dei linfociti CD8+ antigene-specifici 7 3 GAG APC GAG APC 25 CD8 PerCp GAG APC.9 IL-7R PE 2 5 SSC 99. CD8 PerCp GAG APC CD8PerCp 8 CD8+GAG- CD8+GAG+ IL-7R PE % of Max 6 4 IL-7R PE 2

16 Produzione di citochine per la valutazione della risposta immunitaria (ICC staining) CD4+IFNg+ CD8+IFNg+ IFN-g PE 3.72 IFN-g PE 5.5 CD4 APC CD8 PerCP CD4+IL2+ CD8+IL2+ IL-2 PE 2 IL-2 PE 6.29 CD4 APC CD8 PerCP

17 Valutazione dell apoptosi tramite Annexin V Durante l apoptosi le cellule subiscono specifiche modificazioni morfologiche, che portano alla perdita dell integrità della membrana, alla formazione di corpi apoptotici e alla morte della cellula Un cambiamento che avviene nella membrana cellulare durante le prime fasi del processo apoptotico è la traslocazione della phosphatidylserine (PS) dal lato interno della membrana a quello esterno. E possibile rilevare PS utilizzando Annexin V marcata, una proteina di 35 kda che in presenza di specifiche concentrazioni di calcio è in grado di legarsi con alta affinità alla PS.

18 Valutazione dell apoptosi tramite Annexin V Data la sua importanza negli studi dei processi apoptotici, è attualmente commercialmente disponibile annexin V coniugata con una ampia varietà di fluorocromi, da utilizzare in citofluorimetria e microscopia.

19 Valutazione dell apoptosi tramite Annexin V Un metodo molto importante nello studio dell apoptosi utilizza la colorazione dell Annexin V in combinazione con un colorante, che lega gli acidi nucleici, in grado di discriminare tra cellule vive e morte (viability probe). I due coloranti più utilizzati sono PI o 7AAD (7-Amino-actinomycin D). Grazie a questa combinazione possiamo ottenere un profilo dove le cellule vitali risultano negative ad entrambi i markers, quelle nelle prime fasi dell apoptosi sono positive all Annexin V e negative alla viability probe, quelle nella late apoptosi sono positive per entrambi i markers

20 Livelli di apoptosi in SIV infected and uninfected sooty mangabeys 2 um 8 hours 2 um o/n.5.36 campthotecin AAD Annexin V PE late apoptosis necrosis early apoptosis CD CD e SM SIV SM SIV