Perché sintetizzare per via chimica gli oligonucleotidi?

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Lucrezia Abate
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1 Perché sintetizzare per via chimica gli oligonucleotidi? Molte sono le utilizzazioni di oligonucleotidi sintetizzati chimicamente.. Oligonucleotidi sintetici servono: in molti esperimenti in biologia molecolare ed in biochimica, nonché in diagnostica medica come modelli per studi strutturali sugli acidi nucleici come potenziali farmaci in terapie geniche come molecole base per la costruzione di nanomateriali

2 Oligonucleotidi come modelli di acidi nucleici: studio delle possibili conformazioni del DNA e dell RNA

3 Gli acidi nucleici possono assumere molte conformazioni (polimorfismo del DNA e dell RNA)

4 Strutture non usuali del DNA Sequenze particolari di DNA possono formare TRIPLEX (o triple eliche)

5 Strutture non usuali del DNA

6 Strutture non usuali del DNA: cruciformi (A) e forma H del DNA (B)

di DNA+DNA a singolo filamento in un tratto di DNA di sequenza ripetuta (GAA) 42 (TTC) 42.

7 Strutture non usuali del DNA Forma H del DNA (tripla elica + single strand) Immagine ricavata mediante microscopia a forza atomica (AFM) di H-DNA (tripla elica intramolecolare di DNA+DNA a singolo filamento in un tratto di DNA di sequenza ripetuta (GAA) 42 (TTC) 42. Immagini simili sono state ottenute per H-DNA formati da sequenze Py Pu ripetute del gene PKD1.

8 Strutture non usuali del DNA Triplex non canoniche formate da oligonucleotidi sintetici

9 Due triplex modello Strutture (con non usuali inversione del DNA di polarità 3-3 ) messe a confronto P = legame 3-3 fosfodiestereo, che consente l inversione di polarità

10 Strutture non usuali del DNA Modelli molecolari delle due strutture triplex

11 Strutture non usuali del DNA La spettroscopia CD dà informazioni dirette sul tipo di conformazione assunta da un acido nucleico (o un frammento di acido nucleico) Lo spettro CD di una struttura triplex presenta un minimo diagnostico a λ = 220 nm

12 Strutture non usuali del DNA Due sistemi triplex 24-mer con inversione 3-3 a confronto

13 Stabilità di triple eliche di DNA a confronto Strutture non usuali del DNA Profili DSC della triplex 24-mer CT al variare del ph: a) ph = 7.0; b) ph = 6.6; c) ph = 6.4; d) ph = 6.2; e) ph = 6.0.

14 Strutture non usuali del DNA Strutture triplex possono generarsi a partire da una duplex preformata, ma non solo.

15 Strutture non usuali del DNA Filamenti ricchi di Guanine possono formare strutture G-quadruplex Modello di una G-quadruplex Tetrade di Guanine

16 Strutture non usuali del DNA Le G-quadruplex presentano molte topologie di strutture C5' C4' O C3' C2' C2'-endo C1' Base C5' C3' O C4' C2' C3'-endo Base C1'

17 Strutture non usuali del DNA G-quadruplex mono-molecolari

18 Strutture non usuali del DNA Un oligonucleotide che si struttura in una quadruplex ben studiata: l aptamero della trombina Loop

19 Modelli molecolari del cofattore dell eparina II complessato con la trombina e con l aptamero della trombina

20 Oligonucleotidi come farmaci in terapie geniche: possibili approcci Strategia antisenso Strategia antigene Oligonucleotidi come aptameri Ribozimi RNAi (RNA interference)

21 Flusso delle informazioni geniche in cellula mrna proteina DNA

22 Oligonucleotidi antisenso e oligonucleotidi antigene

23 Approccio antisenso nella regolazione dell espressione genica ODN antisenso duplex DNA-RNA mrna DNA proteina

24 Meccanismo d azione degli oligonucleotidi antisenso: 1) inibizione fisica della traduzione e/o 2) attivazione delle RNasi-H endogene

25 Approccio antigene nella regolazione dell espressione genica ODN antigene mrna triplex DNA proteina

26 Applicazioni non-antisenso e non-antigene: Oligonucleotidi come aptameri

27 Si dicono aptameri molecole sintetiche in grado di legarsi in maniera selettiva e con elevata affinità a specifiche sequenze di acidi nucleici, generate mediante un processo di selezione in vitro di ampie librerie combinatoriali di oligonucleotidi sintetici (SELEX). Gli aptameri possono riconoscere: DNA, RNA, proteine, piccole molecole organiche. Presentano un notevole potenziale terapeutico, ma possono rivelarsi utili anche per scopi diagnostici.

28 Gli aptameri possono legare (cioè riconoscere) non solo macromolecole! Esempi: aptamero dell arginina (a) e della citrullina (b)

29 SELEX: Selective Evolution of Ligands by EXponential enrichment T7 RNA polymerase

30 SELEX applicata su miscele in soluzione Questa metodologia è molto efficace se applicata a proteine che, una volta legate al loro target specifico, formano un complesso insolubile!

31 PCR: Polymerase Chain Reaction (Kary B.Mullis, 1983, Premio Nobel per la Chimica 1993) Denaturazione del DNA duplex a 97 C. Aggiunta di oligonucleotidi primer complementari e contemporaneo abbassamento della T a C, per favorire l ibridizzazione dei DNA single strand con le molecole primer. Estensione del primer a 72 C e formazione di DNA a doppia elica da parte di una DNA polimerasi termostabile (Taq polimerasi, isolata dal batterio termofilo Thermophilus aquaticus). (da notare: le DNA polimerasi comuni si denaturano alle alte temperature e non sono più attive!)

32 Ciclo della PCR

33 SELEX: solo oligonucleotidi naturali? Il metodo SELEX consente di preparare opportune librerie di RNA anche modificati, tali da mostrare maggiore resistenza enzimatica e maggiore affinità con il target, sempre che le modifiche introdotte siano tollerate dalla RNA polimerasi T7 (trascrittasi inversa). In alternativa, è possibile preparare RNA modificati chimicamente sfruttando approcci di sintesi classica a partire da una molecola già selezionata come lead compound mediante SELEX.

34 Nucleosidi modificati tollerati dalla RNA polimerasi T7

35 RNA come ribozimi: specifiche sequenze di RNA promuovono l idrolisi di specifici mrna; quest attività è catalitica!

36 Small interference RNA (RNAi)

37 Oligonucleotidi sintetici impiegati in genomica ed in diagnostica medica

38 Identificazione di malattie genetiche complesse. Sviluppo di farmaci 1) specifici per genotipo; 2) specifici per combattere le cause di una malattia piuttosto che i suoi sintomi. Determinazione di mutazioni/polimorfismi. Test genetici (riconoscimento)

39 DNA microarrays/microchips Frammenti di DNA a singolo filamento e sequenza prestabilita sono ancorati ad una matrice solida. Filamenti complementari si ibridizzano specificamente alle sonde immobilizzate e le duplex così formate possono essere rivelate sia qualitativamente sia quantitativamente.

40 DNA microarrays/microchips Utilizzando target opportunamente marcati (con probe fluorescenti o con radioattivo) è possibile misurare quantitativamente il livello di ibridizzazione (cioè la quantità di catene oligonucleotidiche complementari che si sono legate ad uno specifico target). Si definisce array una matrice di prodotti, realizzabile grazie a tecniche di sintesi miniaturizzate basti pensare che sono stati fabbricati microarray di DNA con circa sonde oligonucleotidiche diverse legate su una superficie di un pollice quadrato!

41 Agenti fluorescenti che possono essere coniugati a oligonucleotidi

42 DNA microarrays/microchips

43 Molecular Beacons

44 Micro-array ad alta densità

45 Array ad alta densità di cdna

46 Importanza degli oligonucleotidi modificati e/o coniugati

47 Opportune modifiche chimiche sono essenziali per applicazioni in vivo di oligonucleotidi sintetici Si possono avere modifiche degli oligonucleotidi a livello: a) del legame fosfodiestereo; b) delle unità di ribosio o di 2 - deossiribosio; c) delle nucleobasi; d) modifiche terminali, meglio indicate come coniugazioni.

48 Perché modificare gli oligonucleotidi? Le modifiche di un oligonucleotide possono avere lo scopo di: 1) Aumentarne l affinità nei confronti del target molecolare (coniugazione con molecole intercalanti, uso di basi modificate, legami internucleosidici non carichi); 2) Aumentarne la biodisponibilità, che significa: a) più facile penetrazione in cellula, mediante uso di carrier molecolari, e b) maggiore resistenza alle nucleasi, mediante modifiche ai legami internucleosidici che non sono attaccati dalle fosfodiesterasi.

49 Alcune possibili modifiche dello scheletro oligonucleotidico

50 Modifiche dello scheletro di un oligonucleotide: legami internucleosidici di tipo fosforotioato e fosforoditioato

51 Caratteristiche degli oligonucleotidi fosforotioato

52 Altri esempi di oligonucleotidi modificati: modifiche dello zucchero

53 Confronto fra capacità di ibridizzazione, stabilità in vivo ed attività biologica di 12-mer naturali e modificati

54 Come aumentare l affinità di un filamento oligonucleotidico nei confronti del suo target biologico: uso di intercalanti Un intercalante può essere complessato ad un oligonucleotide, o anche legato covalentemente; esso aumenta le interazioni di Base-stacking

55 Alcuni intercalanti del DNA

57 Peptide Nucleic Acids (PNA): mimici del DNA a struttura peptidica

59 Struttura dei monomeri di PNA 1) Nucleobase; 2) Linker carbossimetilenico; I PNA possono essere sintetizzati usando la chimica dei peptidi (strategia Boc o Fmoc) 3) scheletro di N-2- amminoetilglicina

60 Un metodo di veicolazione in cellula per gli oligonucleotidi prevede l uso di liposomi

61 Sezione di un liposoma, formato da fosfolipidi

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