Espressione allelica del gene MYH in pazienti con poliposi, APC negativi

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1 Università degli Studi G. d Annunzio di Chieti-Pescara Facoltà di Medicina e Chirurgia - Dipartimento di Oncologia e Medicina Sperimentale Sezione di Patologia Molecolare Espressione allelica del gene MYH in pazienti con poliposi, APC negativi M.Cristina Curia, Sabrina De Iure, Serena Veschi, Giandomenico Palka, Renato Mariani-Costantini, Pasquale Battista, Alessandro Cama, Gitana Aceto. Tumori Ereditari, Modena, novembre 2010

2 La poliposi associata ad MYH: adenomi colorettali multipli aumento del rischio di cancro TRASMISSIONE AUTOSOMICA RECESSIVA

3 Mutazioni costituzionali in MYH causano un aumento di transversioni G:C T:A nel genoma Il coinvolgimento di MYH nella poliposi è stato suggerito dall elevata frequenza di transversioni somatiche osservate in alcuni pazienti FAP privi di alterazioni costituzionali di APC

4 AFAP Se storia familiare chiaramente dominante Se storia familiare NON chiaramente dominante - mutazione in APC - mutazione in MYH - mutazione (de novo) in APC

5 DNA Damage, Repair, and Consequences

6 BER replicazione C G C GO danno ossidativo (ROS) OGG1 GO C GO MYH A GO A C riparo GO riparo C G C GO

7 MYH : Adenina-DNA glicosilase specifica per l appaiamento A/G (BER pathway) Mappa: 1p esoni bp 5 regione catalitica comune ad altre glicosilasi BER Motivo Helix-hairpin-helix Specificità del mismatch motivo Fe-S forse coinvolto nel favorire il posizionamento lungo l elica del DNA vari domini di legame al DNA: MSH6, A, endonuclease I apurinica 3 riconoscimento dell 8-oxo-G Domini: proteina: 546 AA Localizzazione subcellulare: Nucleare e mitocondriale Funzione: Coinvolta nel riparo dei danni ossidativi sul DNA Inizia il riparo della A:oxoG a C:G rimuovendo l adenina impropria dallo scheletro di DNA Possiede attività DNA glicosilasica sia verso la A che la 2-OH-A Malattia: Poliposi adenomatosa familiare del colon autosomica recessiva

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9 Obiettivi dello studio Verificare in pazienti APC negativi con poliposi e con mutazione monoallelica di MYH una ridotta espressione dell allele ritenuto WT Valutare l effetto delle singole mutazioni di MYH sull espressione allelica Valutare l espressione allelica relativa in pazienti MYH negativi utilizzando varianti geniche frequenti

10 Primer extension per lo studio della espressione allelica relativa (ASE) Varianti c.972g>c (H324Q nell esone 12) e c.64g>a (V22M nell esone 2) del gene MYH Discriminazione allelica sulla base delle dimensioni

11 Estrazione DNA genomico e amplificazione del gdna nella zona contenente la variante Identificazione di eterozigoti per varianti c.972g>c (H324Q) e c.64g>a (V22M) di MYH mediante DHPLC Estrazione RNA, retrotrascrizione RNA in cdna Amplificazione del cdna nella zona contenente la variante Reazione di primer extension: gdna vs cdna Quantizzazione delle altezze dei picchi corrispondenti ai 2 alleli Calcolo del rapporto di espressione allelica, normalizzazione con il gdna

12 Pazienti senza mutazione di APC Fase 1: analisi del gene APC Pazienti studiati: Metodi combinati : 26 AFAP DHPLC Sequenza automatica Fase 2: analisi del gene MYH Pazienti studiati: 26 AFAP DHPLC Sequenza automatica Espressione allelica germinale

13 Controlli di popolazione 150 controlli genotipizzati per la variante c.972g>c 45 controlli eterozigoti per tale marcatore allelico di eterozigosità Esempi di cromatogrammi relativi all analisi in DHPLC del gdna di alcuni dei controlli in studio

14 Test di validazione della variante c.972g>c (H324Q) di MYH in individui eterozigoti (gdna) Individui N. det Rapporti allelici Media rapporti allelici SD CV % NG N N N N N N GD GD GD GD

15 MUTAZIONI GERMINALI DI MYH IN PAZIENTI CON POLIPOSI, APC NEGATIVI Paziente Esone Cambiamento nucleotidico Conseguenze Fenotipo Familiarità GD 69 2 [c.64g>a] [p.val22met] AFAP NO GD 71 2 [c.64g>a] [p.val22met] AFAP SI (verticale) GD [c.64g>a] [p.val22met] AFAP NO GD 82 7,10 [c.494a>g]+[c.778c>t] [p.tyr165cys]+[p.arg260trp] FAP SI(orizzontale) GD 68 7,12 [c.494a>g]+[c.1121t>c] [p.tyr165cys]+[p.leu374pro] + AFAP NO +[c.972g>c] [p.his324glu] GD 83 9,12 [c.672c>t] +[c.972g>c] [p.asn224asn]+ [p.his324glu] FAP SI(orizzontale) GD [c.972g>c] [p.his324glu] poliposi NO diffusa GD [c.972g>c]+[c.972g>c] [p.his324glu]+ [p.his324glu] AFAP SI (verticale) GD [c.972g>c] [p.his324glu] AFAP SI(orizzontale) GD [c.972g>c] [p.his324glu] FAP SI (verticale) GD [c.972g>c] [p.his324glu] AFAP NO GD [c.1234c>t] [p.arg412cys] FAP SI (verticale) GD [c.1395_1397del]+ [p.glu466del] + FAP SI(orizzontale) [c.1395_1397del] [p.glu466del] GD 117 IVS2 [IVS2+30A>G] poliposi NO multipla GD 118 IVS6 [IVS6+35A>G]+ [IVS15-40C>G] AFAP SI (verticale) IVS15 GD 112#1 IVS12 [IVS12-27C>T] AFAP SI (verticale) GD 48 AFAP Si(verticale) GD 70 AFAP SI(orizzontale) GD 78 AFAP Si(verticale) GD 80 poliposi Si(verticale) diffusa GD 92 AFAP NO GD 107 AFAP Si(verticale) GD 111 AFAP SI (verticale) GD 119 FAP SI (verticale) GD 121 FAP NO GD 140 poliposi gastrica NO

16 Famiglia GD 82 Trasmissione orizzontale FAP 49aa FAP 54aa Y165C eterozigoti composti Y165C mutazioni di MYH R260W

17 Esempi di cromatogrammi relativi a 2 casi eterozigoti per la variante c.972g>c primer primer Allele C Allele G Allele C Allele G GD 79 GD 83

18 Esempi di cromatogrammi relativi a 2 casi eterozigoti per la variante c.972g>c primer Allele C primer Allele C Allele G Allele G GD 102 GD 122

19 Conclusioni Pazienti senza mutazione di MYH possono presentare altre alterazioni del gene a livello germinale quali uno sbilancio d espressione allelica Tali alterazioni genetiche in pazienti con mutazione monoallelica o MYH-negativi potrebbero essere associate ad aumentato rischio di cancro colorettale Se questa ipotesi fosse confermata è consigliabile sottoporre gli individui portatori di sbilancio e i familiari a rischio a protocolli di sorveglianza e prevenzione