Genetica del cancro. Lezione 12. By NA

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1 Genetica del cancro Lezione 12 1

2 Cos e il tumore Le alterazioni genetiche acquisite che portano alla trasformazione maligna sono un esempio di variazione genetica somatica (oltre al mosaicismo per i caratteri genetici nucleari e all eteroplasmia per le mutazioni mitocondriali). Il tumore ha un origine clonale, essendo il suo sviluppo innescato da un alterazione genetica in una singola cellula E l accumulo di alterazioni genetiche in una singola cellula e nel clone che ne deriva che produce gli effetti fenotipici caratteristici del termine malignita. 2

3 I geni nei tumori I geni alterati nel cancro sono definiti oncogeni: questo nome deriva dalla scoperta di geni virali responsabili della trasformazione in tumore delle cellule infettate sono geni che controllano le normali funzioni della cellula: la proliferazione, l apoptosi, il ciclo cellulare... per poterli studiare, come i geni considerati finora bisogna avere dei mutanti: le cellule cancerose sono i mutanti 3

4 I geni nei tumori Vengono suddivisi in alcune categorie a seconda della funzione che svolgono prima della mutazione oncosoppressori proto-oncogeni caretaker (addetti alla manutenzione) landscapers (architetti del paesaggio) 4

5 Modalita di espressione Gli oncosoppressori vengono definiti recessivi. Perche? Perche per manifestare il fenotipo e necessario che entrambi gli alleli siano mutati (anche se le mutazioni possono essere diverse) Attenzione: in questo caso il fenotipo di cui si parla e quello della cellula non dell individuo! Il tumore va considerato come un individuo : all interno dell organismo ci sono cloni ( individui ) che non manifestano il fenotipo perche hanno un allele wild-type. Una cellula di questi cloni per caso muta l allele wild-type: perde la funzione e si manifesta il tumore Gli oncosoppressori sono geni la cui funzione normale non e sensibile alla quantita di prodotto: il mancato funzionamento di un allele non ne pregiudica la funzione. 5

6 Oncosoppressori gatekeepers Questi oncosoppressori vengono definiti gatekeepers : (guardiani) perche regolano funzioni cellulari fondamentali come l innesco della proliferazione, del differenziamento e dell apoptosi. La conoscenza del loro meccanismo di azione ha introdotto il concetto di APLOINSUFFICENZA. APLOINSUFFICENZA: condizione in cui la mancata funzionalita di un allele non provoca la comparsa del fenotipo, ma mette la cellula in condizioni di debolezza. La cellula e eterozigote e il gene puo ancora svolgere la funzione, ma e una funzione non completamente efficace 6

7 Oncosoppressori gatekeepers esempi La perdita del prodotto del gene NF1, mutato nella neurofibromatosi di tipo 1, conduce ad una incontrollata attivita di ras. APC, coinvolto nella FAP, regola la trasmissione di un segnale dalla superficie cellulare al nucleo, che porta all espressione di c-myc La perdita di p53 genera la sindrome di Li-Fraumeni, sottraendo le cellule al processo di apoptosi 7

8 Altri oncosoppressori 8

9 Retinoblastoma Servira come modello per chiarire la teoria del doppio colpo che e stata formulata da Knudson per spiegare il diverso comportamento nei due tipi di retinoblastoma ereditario e non. E servira come modello per comprendere come si puo impostare la ricerca dei geni che controllano le funzioni di base della vita cellulare 9

10 Retinoblastoma e un tumore maligno della retina che si sviluppa nei primi anni di vita puo essere monolaterale (solo un occhio colpito) o bilaterale (entrambi gli occhi) si puo manifestare in forme sporadiche o ereditarie diagnosticate a 7-10 anni, generalmente monofocali (solo in un punto dell occhio) diagnosticate nel primo anno di vita, multifocali (piu punti di un occhio) 10

11 Genetica del retinoblastoma retinoblastoma bilaterale retinoblastoma monolaterale non-penetrante Apparente trasmissione dominante... 11

12 Alfred Knudson Nel 1971 Alfred Knudson analizzo casi di bambini con retinoblastoma sia monolaterale che bilaterale Osservo che: al momento della diagnosi, i bambini che avrebbero sviluppato tumori bilaterali erano piu piccoli di quelli per i quali i tumori sarebbero rimasti monolaterali; con l aumentare dell eta, la frequenza con cui venivano diagnosticati i casi bilaterali cresceva in maniera esponenziale, mentre quella relativa ai casi monolaterali aumentava molto piu lentamente. 12

13 Modello del doppio colpo Knudson propose un modello (two-hit hypothesis) secondo il quale, affinche si abbia il retinoblastoma, e necessario che in una linea di cellule retiniche si verifichino due distinti eventi mutazionali I evento ( hit ) II evento ( hit ) I soggetti con retinoblastoma ereditario hanno ereditato una di queste mutazioni, la quale, pertanto, e presente in tutte le loro cellule retiniche e, quindi, e necessario un secondo evento perche si produca il tumore. Il retinoblastoma sporadico, invece, si forma solo quando due eventi mutazionali indipendenti avvengono nella stessa linea cellulare. Cio si realizza piu raramente, per cui l insorgenza e piu tardiva e i tumori sono invariabilmente monolaterali. 13

14 Il gene del retinoblastoma (Rb) Il primo indizio sulla posizione del gene Rb e stato fornito da soggetti rari affetti da retinoblastomi bilaterali, concomitanti anomalie congenite e assenza di familiarita delezione 13q13-q14 L analisi cromosomica di questi pazienti ha dimostrato la presenza di una delezione del braccio lungo del cromosoma 13 di dimensione variabile ma con condivisione delle bande 13q13-q14: questa osservazione suggeriva che in tale regione si localizzasse un gene predisponente al retinoblastoma 14

15 Rb ed esterasi Questi bambini presentavano anche una delezione di una copia del gene per l enzima esterasi D, enzima di funzione sconosciuta ma facilmente dosabile. Presenta un polimorfismo con due alleli, evidenziabile mediante elettroforesi di proteine. I bambini con una delezione a carico di 13q14 producevano meta della quantita normale di esterasi D ed esprimevano invariabilmente un solo allele. L esterasi con il suo polimorfismo era lo strumento ideale per studiare il gene del retinoblastoma 15

16 Linkage di esterasi e Rb L analisi di linkage esaminando la segregazione del polimorfismo dell esterasi D in famiglie con retinoblastoma ereditario e prive di delezione: gli alleli dell esterasi D segregavano nelle famiglie insieme al carattere retinoblastoma (lod score>3), fornendo indicazione che il gene predisponente alla malattia fosse localizzato a livello della banda 13q14. 16

17 Verifica dell ipotesi di Knudson Una mutazione in un gene del cromosoma 13 che costituirebbe al primo evento secondo l ipotesi di Knudson e presente nelle cellule normali dei portatori Il secondo evento sarebbe consistito nella perdita della copia normale rimanente di questo gene... Per testare questa ipotesi si e usata nuovamente l esterasi D, espressa nelle cellule del retinoblastoma, per vedere quali suoi alleli fossero espressi I tumori analizzati erano stati ottenuti da soggetti eterozigoti per il polimorfismo dell esterasi D e non portatori di delezione costituzionale del cromosoma

18 Verifica dell ipotesi di Knudson Atteso: entrambi gli alleli avrebbero dovuto essere espressi Osservato: solo un allele viene espresso in 2/3 dei tumori analizzati? il secondo evento consisteva probabilmente in una delezione che includeva i loci sia dell esterasi D che del retinoblastoma Per la verifica del secondo evento, si puo ricorrere a tecniche di biologia molecolare, come il Southern Blot di DNA dei soggetti di una famiglia affetta usando sonde del cromosoma 13 per testare la perdita di eterozigosita (LOH) 18

19 Perdita di eterozigosita LOH famiglia con figlia affetta da retinoblastoma: RFLP dell esterasi D Cellule tumorali omozigote eterozigote eterozigote LOH 19

20 LOH La LOH si puo applicare sia ai tumori familiari che a quelli sporadici, suggerendo che, in entrambi i casi, gli eventi che conducono allo sviluppo del tumore interessino un locus sul cromosoma 13. C e una cosa da tenere presente: le cellule tumorali hanno lo stesso background genetico delle normali perche appartengono allo stesso individuo: le differenze fra loro sono imputabili al processo tumorale, non alla variabilita genetica e questo permette di utilizzare anche gli sporadici Nei casi familiari, gli alleli mantenuti nel tumore erano invariabilmente quelli ereditati dal genitore affetto 20

21 Meccanismi di acquisizione della seconda mutazione + + Rb -- Non disgiunzione e duplicazione C.O mitotico + Rb delezione mutazione puntiforme + Rb Conversione genica Rb Rb Rb Rb + Rb x Rb Rb Rb + 21

22 Clonaggio del gene del retinoblastoma la ricerca del gene si è concentrata sulla banda 13q14 e si sono cercate le sequenze espresse nelle cellule retiniche normali, che risultassero mutate nei soggetti affetti da retinoblastoma familiare il punto di partenza è stato fornito dalla scoperta di un gruppo di tumori che presentavano una delezione omozigote corrispondente ad una sequenza di DNA clonata dalla regione 13q14 22

23 Clonaggio del gene del retinoblastoma Nel retinoblastoma il trascritto era assente o di dimensioni molto diversi dal normale pazienti con retinoblastoma ereditario portatori di tumori con delezioni omozigoti presentavano delezioni eterozigoti nei tessuti costituzionali... Ipotesi di Knudson confermata! Rb e un oncosoppressore 23

24 Ricerca delle mutazioni In molti casi le mutazioni non consistono in delezioni o alterazioni a carico del gene tali da poter essere individuate con Southern blot, ma in mutazioni puntiformi piu difficili da evidenziare test molecolare: sequenziamento esonico dopo PCR per rivelarle 24

25 Il materiale didattico e presente in rete: NON sono dispense, ma un ausilio allo studio sul libro 25