nei tessuti biologici e in varie condizioni sperimentali Prof.ssa: Diana Conte Dott.ssa: Giulia Maria Camerino

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1 REAL-TIME PCR QUANTIFICAZIONE DELL ESPRESSIONE ESPRESSIONE GENICA Un metodo per misurare l mrnal nei tessuti biologici e in varie condizioni sperimentali Prof.ssa: Diana Conte Dott.ssa: Giulia Maria Camerino

2 Identificazione del meccanismo di azione dei farmaci Farmaco che modula l espressione l di una proteina! Modificazione POST-TRASCRIZIONALE TRASCRIZIONALE Tecniche di BIOCHIMICA Modificazione ESPRESSIONE GENICA REAL-TIME TRASCRIZIONE RNA DNA POST TRASCRIZIONE FUNZIONE

3 Identificazione delle sostanze in grado di modulare l espressione genica di una proteina Estrazione dell RNA totale da tessuto RNA totale Retro-trascrizione trascrizione del mrna tot. in cdna cdna analisi Real-time PCR

4 FASE 1. TRATTAMENTO PRELIEVO DEI TESSUTI CONGELAMENTO DEL TESSUTI CONSERVAZIONE A -8O C

5 FASE 2. OMOGENIZZAZIONE DEI TESSUTI Per poter estrarre l RNA l dalle cellule dei tessuti è necessario frantumare il tessuto e rompere le cellule che lo costituiscono: Possibili metodi per la rottura delle cellule: Metodi meccanici Vibrazioni ultrasoniche Agenti litici responsabili della lisi celulare METODO MECCANICO: 1. CONGELAMENTO DEL TESSUTO IN GHIACCIO SECCO OAZOTO LIQUIDO 2. POLVERIZZAZIONE DEL TESSUTO CON IL PESTELLO 3. LISI CELLULARE ATTRAVERSO L OMOGENIZZAZIONE L CON IL POLITRON (la polvere del campione in soluzione di lisi)

6 FASE 3. Estrazione dell RNA totale da tessuto RNA totale Retro-trascrizione trascrizione del mrna tot. in cdna cdna analisi Real-time PCR

7 ESTRAZIONE DEL RNA TOTALE DA TESSUTO Esistono 2 metodi fondamentali per l estrazione degli acidi nucleici le quali vengono scelte asseconda della quantità disponibile del materiale di partenza METODO TRADIZIONALE METODO ALTERNATIVO ESTRAZIONE CON FENOLO ACIDO UTILIZZO DI KIT CON MEMBRANE DI SILICE

8 MEDTODO DEL FENOLO ACIDO: fenolo acido-guanidina tiocianato (Trizol ) Sostanze contenenti 2 fasi: una fase organica in qui si deposita il DNA passa nella fase organica se il fenolo è tamponato con una soluzione a ph acido 5-6, e una fase organica in qui si deposita l RNA. Dopo l omogenizzazione effetuata direttamente in Trizol i campioni vengono centrifugati per consentire eliminazione dei residui cellulari Dopo un incubazione a temperatura ambiente, al campione viene aggiunto il cloroformio e miscelato Dopo una seconda centrifugazione, la soluzione sarà divisa in tre fasi: FASE AQUOSA:Contenente L RNA INTERFASE:Contenente le proteine FASE FENOLICA:Contenente il DNA La fase acquosa separata dalle altre viene miscelata con isopropanolo centrifugata per ottenere un pellet di RNA che viene prima lavato con una soluzione contenete etanolo (75%) e acqua e poi risospeso in acqua RNAsi free.

9 MEDTODO ALTERNATIVO: COLONNINE DI SILICE Principio: gli acidi nucleici si legano alla matrice di silicio in presenza di Sali di caotropici (presenti nelle soluzioni di lisi cellulari), la matrice di silicio non lega sostanze contaminati presenti nei campioni come proteine e residui cellulari Tessuto Il campione nella soluzione di lisi viene caricato nella colonnina al silice e centrifugato Tessuto in soluzione di lisi, viene omogeneizzato con il potter La membrana alla quale sono legati gli acidi nucleici, viene lavata con soluzioni saline in modo da eliminare i residui contaminati dei tessuti e gliacidi nucleici rimangono legati alla membrana Alla soluzione viene addizionato etanolo Con una soluzione acquosa senza sali di caotropici l RNA si slega dalla membrana e vinene recuperato Maggiore efficienza di estrazione e un più elevato livello di purificazione del RNA rispetto ai metodi classici

10 RNasi PRESENTI NEL AMBINETE POSSONO DEGRADARE L RNA DEI CMPIONI PROTEZIONE DALL ATTIVITA ATTIVITA DELLE RNasi: RNase inibitor: : proteine in grado di legare covalentemente l RNasi e inibire al 90% la loro attività SOLUZIONI CONTENENTI DIETILPIROCARBONATO (DEPC) agente alchilante che reagisce con le proteine attaccando i residui istidinici determinando la perdita del attività enzimatica Evitare che l RNasil presenti sulla pelle degradino l RNA l dei campioni (utilizzo costante di guanti)

11 FASE 4. Estrazione dell RNA totale da tessuto RNA totale Retro-trascrizione trascrizione del mrna tot. in cdna cdna analisi Real-time PCR

12 TRASCIZIONE INVERSA DEL RNA La trascrizzione inversa consente di produrre una molecola di cdna (DNA complementare) partendo da una molecola di RNA, grazie all utilizzo di un enzima DNA polimerasi RNA dipendente (enzima identificato per la prima volta nei retrovirus come ad esempio Avian Myeloblastosis Virus) 5 3 AAAAA mrna oligo esa nucleotidi random APPAIAMENTO DEGLI RANDOM PRIMER 5 mrna 3 AAAAA 3 cdna 3 5 cdna 5 SINTESI DEL cdna per ottenere una molecola ibrida cdna-rna Eliminazione dell RNA tramite l utilizzo dell RNase

13 Estrazione dell RNA totale da tessuto RNA totale Retro-trascrizione trascrizione del mrna tot. in cdna cdna FASE 4. analisi Real-time PCR

14 REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR) La Polymerase Chain Reaction (PCR) è una tecnica che permette di amplificare una specifica sequenza di DNA milioni di volte in poche ore. Inventore della PCR nel 1983 Premio Nobel per la Chimica nel 1993 Mullis, K.B.,Faloona, F.A., Methods Enzymol. 1987, 153, La PCR si basa sullo stesso meccanismo di duplicazione che si svolge nelle cellule

15 REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR) Per effettuare una reazione di PCR, sono necessari: Stampo,una piccola quantità di DNA che si vuole amplificare (DNA Target) L operaio,, l enzima l polimerasi che sintetizza il DNA i mattoni,, una riserva di nucleotidi liberi costituita da Adenina, Timina, Citosina, Guanina Innesco,2 primer: : sequenze di DNA a singola filamento (20-30 nucleotidi) sintetizzate artificialmente, hanno la funzione di innescare la reazione di sintesi [un primer (for) è complementare a un filamento di DNA all inizio della regione bersaglio; l altro l (Rev( Rev) è complementare all altro altro filamento, alla fine della regione bersaglio]

16 FASI DELLA PCR La reazione a catena della polimerasi avviene in tre fasi successive, sive, ognuna delle quali si svolge ad una temperatura specifica. STAMPO 96º 1 FASE Denaturazione: I 2filamenti di DNA si separano 50º 2 FASE Appaiamento:I primers si attaccano alle sequenze complemetari al gene target 72º Taq 3 FASE Taq Taq Taq Taq Taq Legame della polimerasi e Estensione: La Taq si lega ai primers e rapidamente copia il DNA In 30 cicli si ottengono un miliardo di molecole di DNA.

17 Polymerase Chain Reaction: resa STAMPO 1 ciclo 2 copie 2 ciclo 4 copie Durante la reazione di PCR la quantità di DNA cresce in modo esponenziale

18 Polymerase Chain Reaction: resa teorica e resa effettiva La resa reale della PCR non è esponenziale ma raggiunge un plateau dove non si osserva nessun incremento dei prodotti DNA (Log) 1.E+09 1.E+06 PCR ideale PCR effettiva 1.E Cycle Number 30 Il processo di duplicazione della PCR è limitato dalla quantità dei primers,, attività della Taq polimerasi, nucleotidi e substrati

19 PCR reaction progression Esponeziale: L efficienza della reazione di amplificazione e assimilabile al 100%. 0%. il DNA si amplifica in maniera molto precisa e specifica, i reagenti sono freschi. Lineare: L efficienza della reazione di amplificazione diminuisce. Il DNA si amplifica piu lentamente, i reagenti iniziano a degradarsi. Plateau: La reazione di amplificazione si ferma. Il DNA non è piu amplificato, i reagenti sono tutti degradati (END-POINT) Log. DNA Gel Et Br Real-time Cicli di PCR La real-time misura l'amplificazione durante la fase esponenziale della PCR, quando cioè l'efficienza di amplificazione è influenzata minimamente dalle variabili di reazione permettendo di ottenere risultati molto più accurati rispetto alla PCR tradizionale "end point

20 LINIARE LOGARITMICA Concentrazine del DNA Log Concentrazine del DNA

21 Real-time time-pcr Misura l amplificazione l del DNA o cdna a ogni ciclo di PCR,, ( in tempo reale ) durante la fase esponenziale della reazione. Si serve di marcatori fluorescenti, cioè di molecole che variano la loro fluorescenza quando si legano al DNA La fluorescenza varia in proporzione alla quantità di amplificato.

22 SONDE FLUORESCENTI Molecole in grado di legarsi in maniera specifica o aspecifica al DNA amplificato ed emettere fluorescenza. DETECTION NON SPECIFICI: emettono fluorescenza quando si intercalano sulla doppia elica di DNA, sono definite sonde intercalanti (SYBR Green, YOYO) DETECTION SPECIFICI: sono costituite da un piccolo filamento di DNA complementare alla sequenza di analisi, alle cui estremità 3 e 5 5 sono legati 2 fluorofori,, sono definiti probes (Hydrolysis probes, Hybridisation probes, Molecular beacons) Nonspecific chemistries SYBR TM Green SYBR TM Gold YoYo TM -1 Yo-Pro TM -1 Amplifluor Quencher-labelled primers I Quencher-labelled primers II Lux TM primer Specific chemistries TaqMan TM Hybridisatin Molecular Beacons Lanthanide ResonSense TM Angler TM Hybeacons TM Light-up TM Eclipse TM Ds complex probes Cyclicons TM Nanoparticles

23 SYBR GREEN E un intercalante del DNA, simile al EtBr,, possiede anche una lieve fluorescenza quando è in soluzione,che aumenta quando si intercala con il doppio filamento di DNA, durante la fase di estensione. stampo 72º Estenzione 96º Denaturazione Taq Taq Taq Taq 96º Denaturazione 50º Appaiamento Non è un marker specifico, in quanto lega qualsiasi DNA a doppia elica in soluzione, pertanto richiede una lunga ottimizzazione.

24 CURVE DI DISSOCIAZIONE: TIME MELTING Per alcuni saggi (intercalanti, hybridisation probe) dopo la reazione di PCR è possibileottenere le curve di Melting: : viene rivelata la fluorescenza mentre i campioni vengono riscaldati (50 C-95 C) La fluorescenza aumenta quando il DNA è a doppia elica (Tm( Tm), diminuisce quando il DNA è denaturato Tm Le curve di melting sono utili nei saggi SYBER green in quanto consentono di individuare con precisione la presenza di un singolo amplificato, in quanto a ogni picchio corrispone uno specifico amplicone

25 TAQMAN La sonda è costituita da una piccola sequenza di DNA complementare alla sequenza target, sui 5 5 e 3 sono coniugati il quencer e il reporter La Taq polimerari è fornita di attività 5-3 eso-nucleasica che gli permette di eliminare i nucleotidi che si trovano di fronte, in questo modo la Taq digerisce la sonda appaiata al DNA target stampo 5' 3' 3' 5' Denaturazione 5' 3' 3' 5' Appaiamento R = Reporter Q = Quencher Forward Primer R Probe Q 5' p3' 3' 5' 5' 3' 5' Reverse Primer Estensione Forward Primer R Probe Q 5' Taq p3' 3' 5' 5' 3' Taq 5' Reverse Primer Digestione della sonda R Q 5' Taq p3' 3' 5' 5' 3' Taq 5' Polimerizzazione completata R Q p 3' 5' 3' 5' 5' 3' 5'

26 MOLECULAR BEACONS Il Probe è costituito da un piccolo filamento di DNA, con il quencer e reporter coinigate alle 2 estremità 3 e Il filamento di DNA è costituito da una frazione specifica alla sequenza target e due frazioni vicine ai fluorofori disegnate in modo da richiudere il Probe in una forma ad anello. Loop: Sequenza di basi, complemetare alla sequenza targt. Stem: 5-7 basi (Tm C) conigata al 3 e 5 con il reportere e il quencher Dyes: Reporter: Fluo, Fam, Hex, Tet, Rox, Tamra, Cy3, Cy5, Quencher: BHQs, Dabcyl, R stampo Denaturazione Appaiamento Q Prodotto di PCR R Q

27 HYBRIDISATION PROBE Si serve di due Probe distinti, per ottenere il MASSIMO della SPECIFICITA ECIFICITA, Fluorescenza FRET. 1) Probe 3 3 fluoroforo Donatore (CFP) 2 )Probe 5 5 fluoroforo Accettore (YFP) I due Probes devono avere una distanza nella sequenza target nucleotidi (20 A) stampo Denaturazione (Primer in soluzione) I Probes sono in soluzione: Il donatore è fluorescente (480 nm) Annealing I fluorofori sono vicini L accettore è fluorescente (535 nm) Sintesi Denaturazione (Primer in soluzione) I Probes sono di nuovo in soluzione: Il donatore è fluorescente (480 nm)

28 DISEGNO DELLE SONDE: PRIMER EXPRESS Ricerca delle sequenze nucleotidiche dei geni target Utilizzo di programmi specifici per il disegno delle sonde (esempio TaqMan) PROBE Primer For Primer Rew Il Probe è disegnato in modo da trovarsi in una giunzione fra due esoni ESON Primer ESON INTRON PROBE ESON ESON Primer Diminuire il rischio di contaminazioni genomiche nel campione. (il campione va comunque trattato con DNAse-free )

29 Preparazione di un esperimento di real-time In ogni pozzetto vengono inseriti : Mix pre-impostata Primer For e Rev Sonda Campione di cdna Le Taq sono termostabili e si attivano a 95 C C pertanto è possibile caricare i campioni a temperatura ambiente A B C D E F G H Step di attivazione Cicli Appaiamento e estensione Tutti i campioni vengono caricati sulla multiwell in triplicato in modo da ottenere dati più accurati Denaturazione

30 La quantificazione nella Real-Time PCR Il valore della fluorescenza misurata durante ogni ciclo di PCR rappresenta una misura della quantità di DNA amplificato a ogni ciclo. Threshold : Linea soglia scelta in maniera da intersecare le curve di tutti i i campioni nella fase esponenziale Threshold cycle (Ct):: il punto di intersezione fra il threshold e la curva di amplificazione del DNA, numero di cicli del campione alla fluorescenza del threshold Log. Fluorescenza Threshold Ct Ct cicli Basso alto A Ct più alto corrisponde una quantità di iniziale di gene target più basso, perché saranno necessari un numero di cicli di PCR maggiori per arrivare alla fluorescenza del threshold La quantità iniziale di DNA o cdna è inversamente proporzionale al numero di cicli necessario ad arrivare al threshold (Ciclo soglia, Ct)

31 GENE ENDOGENO: HOUSE KEEPING GENE Per poter paragonare l espressione l del gene target in tessuti differenti è necessario normalizzare i valori ottenuti con quelli derivanti da un gene endogeno che si mantiene costante in tutti i campioni Vandesompele et al.genome Biology 2002

32 Estrazione dell RNA totale da tessuto RNA totale Retro-trascrizione trascrizione del mrna tot. in cdna cdna FASE 6. analisi Real-time PCR

33 QUANTIFICAZIONE RELATIVA ASSOLUTA La quantità di RNA di partenza è calcolata relativamente in base ad un RNA interno (controllo endogeno) con il metodo Δ Δ Ct La quantità di RNA di partenza è identificata utilizzando degli standard a concentrazione nota di DNA o cdna (interpolazione con la retta degli standard)

34 QUANTIFICAZIONE ASSOLUTA DELL RNA In parallelo con i campioni da analizzare viene analizzato un campione a concentrazione nota di RNA o cdna Standard Diluizioni seriali dello standard Per interpolazione della retta ottenuta con lo standard viene calcolata la concentrazione dell RNA dei campioni ignoti RATIO : Conc.. del gene target Conc.. del gene endogeno

35 QUANTIFICAZIONE RELATIVA : Metodo del Ct Ct= Ct campione ignoto gene target Ct campione ignoto gene housekeeping Ct= Ct campione ignoto Ct campione di riferimento Il campione di riferimento è un campione ignoto la qui quantità di RNA viene arbitrariamente considerata pari a 1 Controllo Campione Questo metodo è valido se il gene taget e l l housekeeping possiedono la stessa efficienza di amplificazione ΔC T

36 APPARECHIATURA PER LA REAL TIME PCR sistema a fluorescenza in grado di emettere e leggere la florescenza (CCD CAMERA) COMPUTER IN GRADO DI RACOGLERE E ELABORARE I DATI ciclo termoregolatore

37 VANTAGGI Sensibilità, 10 7 volte più preciso rispetto ai metodi classici Affidabilità, grande ripetitività delle situazioni sperimentali Specificità, possibilità di utilizzare sonde altamente specifiche Rapidità SVANTAGGI Richiede un alta conoscenza della tecnica Alti costi della strumentazione e dei substrati