Le basi azotate sono 4: 1. due purine: adenina e guanina; 2. due pirimidine: citosina e timina.

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2 DNA DeoxyriboNucleic Acid Acido DesossiriboNucleico È formato nuceleotidi composti da: 1. Gruppo fosfato; 2. Zucchero (desossiribosio); 3. Base azotata.

3 Le basi azotate sono 4: 1. due purine: adenina e guanina; 2. due pirimidine: citosina e timina. L adenina è sempre legata alla timina (A=T) con due legami idrogeno, mentre la citosina è sempre legata alla guanina (G C) con tre legami idrogeno.

4 Il genoma (o patrimonio genetico) è l insieme di tutte le informazioni scritte nella sequenza creata dai nucleotidi nel DNA Il cromosoma è la struttura con cui, durante il processo riproduttivo della cellula, ciascuna unità funzionale di DNA, dopo essersi duplicata, si compatta associata a specifiche proteine e viene trasmessa alle cellule figlie.

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7 Prima della divisione cellulare il DNA viene fedelmente copiato. Ogni cellula figlia riceve un patrimonio genetico identico a quello della cellula madre. La replicazione del DNA avviene nel nucleo. Questo fenomeno è catalizzato da proteine specializzate.

8 Il gene è un tratto di DNA che contiene un informazione genetica ereditata di generazione in generazione. Molti dei nostri geni codificano per le proteine, cioè contengono il messaggio per fare una proteina. Altri codificano per le molecole di RNA. Altri hanno una funzione di regolazione. Altri non hanno ancora una funzione nota. Una proteina è una molecola formata da aminoacidi. Le proteine hanno ruoli funzionali e strutturali nelle nostre cellule. Per esempio formano le fibre muscolari (actina e miosina), oppure rendono possibili tutte le reazioni biochimiche (per esempio quelle necessarie per metabolizzare il glucosio o sintetizzare i grassi).

9 Il DNA codifica per le proteine. La sequenza di nucleotidi del DNA contiene un messaggio che viene prima copiato in mrna e poi tradotto in proteine. La trascrizione in mrna e la traduzione in proteina permettono di passare dal genotipo al fenotipo. Un gene è espresso quando è copiato in mrna e tradotto in proteina.

10 Il DNA viene copiato in mrna mediante il processo di trascrizione. Si passa dall alfabeto A, G, C, T a quello A, G, C e U. E un processo simile alla replicazione ma riguarda solo pochi geni. I geni espressi variano nelle diverse cellule e nel tempo.

11 Il DNA viene copiato in mrna prima di essere tradotto in proteina. L RNA (acido ribonucleico) è formato da un solo filamento, lo zucchero è il ribosio e al posto della timina c è l uracile (U), mentre le altre tre basi sono identiche (A, G, e C). Esistono diversi tipi di RNA, quelli che dovete ricordare sono: mrna, trna e rrna.

12 mrna (RNA messaggero): porta l informazione genetica per sintetizzare una proteina dal nucleo al citoplasma. trna (RNA di trasferimento): trasporta gli aminoacidi verso il ribosoma dove avviene la sintesi delle proteine. rrna (RNA ribosomiale): forma, insieme ad alcune proteine, il ribosoma che provvede alla lettura e alla traduzione del messaggio contenuto nell mrna. snrna (small nuclear RNA) e mirna (micro RNA): hanno una funzione di regolazione dell espressione dei geni.

13 Ma come si passa dal DNA alla proteina? La sequenza dei nucleotidi ha un significato ben preciso. Tre nucleotidi (tripletta o codone) individuano uno specifico aminoacido. Cioè tre lettere del DNA corrispondono a una lettera delle proteine. Questo è il codice genetico. Nel processo di traduzione le triplette vengono lette e decodificate. Ognuna codifica per un aminoacido diverso. La proteina nasce grazie all aggiunta di un aminoacido alla volta, secondo il messaggio portato dall mrna.

14 Il ribosoma è una macchinetta, formata da rrna e proteine, che permette la lettura del messaggio dell mrna, e grazie ai trna, la sintesi della catena aminoacidica, cioè della proteina.

15 Non tutti i geni sono espressi in tutte le cellule e in ogni momento: la regolazione genica

16 Identificazione dei microrganismi METODI GENOTIPICI - Approccio polifasico: combinazione delle informazioni genetiche con le caratteristiche fenotipiche: identificazione affidabile a livello di specie Genotipo: è l informazione genetica, ossia la costituzione genetica di un organismo che agendo con i fattori ambientali determina il fenotipo. Fenotipo: modo in cui il genotipo è espresso, ossia l insieme delle caratteristiche biochimiche e fisiologiche misurabili e visibili. Esempio: informazione contenuta (genotipo) in una sequenza nucleotidica (informazione genetica) che codifica per un enzima (fenotipo).

17 1. Lisi delle cellule. La dissoluzione della cellula (distruzione della membrana) è una fase delicata in quanto risultato di due eventi contrastanti: l esigenza di frammentare il materiale di partenza e quella di non alterare gli acidi nucleici da analizzare. 2. Separazione e recupero dell acido nucleico dalla soluzione contenente il lisato cellulare. Un primo metodo per effettuare tale operazione prevede l uso di solventi organici (come fenolo o cloroformio), che consentono la separazione degli acidi nucleici dai contaminanti (proteine); successivamente, dopo centrifugazione, gli acidi nucleici vengono recuperati in soluzione acquosa. 3. Precipitazione: avviene di solito in alcol etilico o isopropanolo e permette il recupero degli acidi nucleici in forma solida. Dopo lavaggio con etanolo, si ha una valutazione quali-quantitativa degli acidi nucleici estratti e quindi la loro conservazione

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19 MATERIALE: cucchiaio da laboratorio; provette d 15ml; spatola; spruzzetta. Pipette Pasteur lievito di liquido; detersivo liquido; un kiwi; alcol etilico (etanolo); cloruro di sodio. PROCEDIMENTO Prelevare un 5ml di lievito riporlo nella provetta Aggiungere cloruro di sodio (NaCl) Aggiungere detergente liquido per piatti Agita lentamente per evitare la formazione di schiuma. Aggiungere con una pipetta Pasteur del succo di kiwi (contiene l enzima proteolitico) Lasciare reagire per 30 minuti Aggiungere alcol etilico freddo molto lentamente in modo da farlo stratificare sul liquido acquoso (operare con un contagocce e inclinare la beuta durante l operazione) Osservare la presenza di cristalli fioccosi bianchi formati da agglomerati di DNA

20 Meccanismo molecolare Il processo di PCR consiste nella ripetizione ciclica di tre passaggi: Denaturazione del DNA al calore (95 ) Annealing o appaiamento dei primer al templato (50-60 C) Estensione: la polimerasi sintetizza nuovi filamenti basandosi sulla sequenza del templato. (72 C) I due primer sono complementari ai filamenti opposti e precisamente essi si appaiano alle due estremità 3 del segmento di DNA da amplificare. In questo modo offrono l innesco per la polimerasi che sintetizza in direzione 5 3. E necessario che i primer siano aggiunti in eccesso rispetto alla quantità di DNA da amplificare.

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22 DNA genomico= stampo TAQ POLIMERASI = DNA polimerasi termoresistente dntps = datp + dttp + dgtp + dctp Tampone MgCl 2 PRIMER = oligonucleotidi sintetici per l innesco della reazione di sintesi Per ottenere una corretta amplificazione del DNA è indispensabile impiegare soluzioni non contaminate: Utilizzare attrezzature sterilizzate Cambiare sempre puntali e utilizzare i guanti. DNA PCR buffer MgCl2 dntps Primer Forward Primer Reverse Taq Polimerasi H20

23 Buffer 10X (50mM di KCl, 10mM Tris-HCl ph 9, 0.1% Triton 100) Serve per creare un ambiente idoneo per il funzionamento e mantenimento della Taq polimerasi MgCl 2 (la concentrazione può variare da 1.25mM-1.5mM) Basse concentrazioni riducono l efficienza. Alte concentrazioni diminuiscono la specificità provocando l appaiamento dei primer con il templato senza che ci sia omologia totale e favoriscono l incorporazione di nucleotidi errati. dntps Alte concentrazioni di dntps portano ad una diminuzione della fedeltà perché l enzima ha maggiore probabilità di recuperare dntps sbagliati in soluzione. Basse concentrazioni bloccano la reazione dando una resa inferiore. Primer La concentrazione dei primer non deve essere troppo bassa, altrimenti non procede la reazione, né troppo alta per non favorire l appaiamento aspecifico tra primer e templato. Taq polimerasi Tutte le DNA polimerasi aggiungono deossiribonucleotidi al terminale 3 di una molecola di primer di DNA a doppia elica. La sintesi avanza esclusivamente in direzione 5-3 rispetto al filamento sintetizzato. Ogni nucleotide che viene incorporato durante la polimerizzazione è complementare al suo opposto sul templato. La reazione di sintesi richiede i 4 deossiribonucleotidi trifosfato(dntps) e ioni magnesio.

24 Il numero di nuove molecole aumenta al succedersi di ogni ciclo. Durante il primo ciclo da una singola molecola di DNA ne ottengo due. Al secondo ciclo ciascuna delle diventano quattro. In teoria quindi ad ogni ciclo il numero di copie della sequenza bersaglio aumenta in maniera esponenziale, di fatto, il numero di copie si duplica ad ogni ciclo fino al raggiungimento di un plateau. Nelle fasi tardive dell amplificazione il tasso di accumulo di prodotto diminuisce a causa di numerosi fattori tra cui la degradazione dei reagenti (dntps, DNA polimerasi) e dall accumulo dei prodotti.

25 93-95 C 5-10 min Denaturazione inziale Questo passaggio prevede una denaturazione iniziale, senza compromettere l attività della polimersi C 30 sec-1 min Denaturazione Durante questo passaggio si ha la denaturazione del DNA. Temperature più alte provocherebbero la degradazione del Taq polimerasi, mentre temperature più basse causerebbero una parziale denaturazione dei filamenti e di conseguenza una minore resa C 30 sec-1 min Appaiamento È il passaggio più delicato per l efficacia della PCR. Si verifica un appaiamento dei primer al templato. Determina la specificità dell appaiamento. Dipende dalla temperatura di melting dei primer (temperatura alla quale la metà dei primer è dissociata dal templato). Una temperatura molto elevata diminuisce l efficienza, in quanto i primer si legano poco al templato. Una temperatura molto bassa permette ai primer di legarsi in modo aspecifico con conseguente amplificazione di frammenti di interesse nullo. 72 C per 30-sec-1 min Estensione. T annealing = T melting - 5 T melting= (A+T)*2+(G+C)*4 Durante questa fase si verifica l allungamento dei filamenti. L alta temperatura evita la formazione di strutture secondarie forti da parte del templato, che impedirebbero l azione di alcune delle polimerasi. Il tempo dipende dalla lunghezza del filamento da amplificare e dalla velocità di polimerizzazione dell enzima scelto. 72 C per 5-10 min Estensione finale Per completare i filamenti non terminati. RIPETERE gli ultimi 3 passaggi per cicli

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28 Concentrazioni finali Concentrazioni iniziali Buffer 10X MgCl 2 50 mm dntps 2,5 mm Primer 10 µm Taq 5 U H 2 O DNA 3 µl