LARS BIOTEC Laboratorio di Ricerca sperimentale nel settore delle Biotecnologie

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1 LARS BIOTEC Laboratorio di Ricerca sperimentale nel settore delle Biotecnologie!

2 Indice 1. Introduzione 2. Bioinformatica 3. SDS Page: Elettroforesi 4. Soluzione, diluizioni e Biureto 5. Analisi utilizzo di Imagej Template foglio di calcolo 6. Conclusione

3 Introduzione Il progetto Lars-Biotec consiste in un pacchetto di esperienze laboratoriali nel campo delle Biotecnologie; quest'anno il laboratorio comprendeva esperienze riguardanti l'analisi, sia quantitativa che qualitativa, delle proteine. Le esperienze sono state sviluppate in itinere direttamente con gli studenti, che hanno messo a punto i protocolli per la corretta conduzione delle analisi. La parte di progetto di quest'anno ha preso in esame: Bioinformatica: analisi delle proteine e dei loro geni codificanti, utilizzando le banche dati genomiche e proteomiche e loro visualizzazione e analisi in 3D. Preparazione di soluzioni proteiche e analisi con il metodo di Lowry (o analisi con il biureto). Preparazione dei gels in poliacrilammide (staking gel e running gel). SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis): elettroforesi su gel di poliacrilammide per l'analisi delle soluzioni proteiche. Analisi dei gels con i programmi ImageJ e fogli di calcolo. Vengono riportate di seguito brevi relazioni sull operato e i protocolli operativi delle varie fasi del progetto.

4 Bioinformatica Nella prima fase del nostro progetto è stata importante l analisi delle banche dati online. La bioinformatica ci permette di risolvere problemi biologici a livello molecolare con metodi informatici. Inizialmente abbiamo consultato una serie di banche dati genomiche e proteiche e così via. Il sito ( ci permette di consultare e prelevare i dati contenuti in banche dati (nucleotidiche, proteiche, strutturali) ed è possibile ottenere la sequenza desiderata in formato FASTA. Nel formato FASTA ogni sequenza viene scritta con una riga di intestazione, preceduta dal simbolo >, seguita nelle righe successive dalla sequenza stessa. Più sequenze possono essere scritte una sotto l altra. Le sequenze in formato FASTA sono molto importanti perché molti programmi di analisi sono in grado di riconoscerne solo alcuni e questo formato è uno dei più semplici. All interno del sito NCBI, si possono anche confrontare le varie sequenze di DNA, in formato FASTA. Una volta effettuato l allineamento (confronto) tramite BLAST, otterremo una rappresentazione grafica delle parti in comune delle sequenze in esame. Questo strumento risulta molto utile, per comparare i DNA di specie differenti e per capirne il grado di parentela. Consultando il sito PDB ( Protein Data Bank ) è possibile scaricare il file della proteina in esame in formato pdb. Le informazioni contenute nel formato.pdb permettono di visualizzare la struttura tridimensionale della proteina utilizzando il programma VMD scaricabile dal sito Il programma ci permette inoltre di modificare le varie impostazioni e modalità di visualizzazione del modello.

5 Protocollo NCBI Aprire la pagina selezionare in alto a sinistra ( alla voce All Databases ) il campo di ricerca desiderato e inserire il termine ES. voce PROTEIN e si inserisce il termine Hemoglobin si sceglie il file da aprire e si ottiene un'altra pagina contenente informazioni varie come il nome dell'organismo da cui deriva, l'autore, ecc. selezionando in alto a sinistra la voce FASTA verrà fornita la sequenza di amminoacidi della proteina volendo effettuare una ricerca di sequenze simili bisogna selezionare la voce Run BLAST sotto Analyze this sequence successivamente il sito apre una pagina nella quale è possibile, compilando i campi di ricerca per limitare il numero dei risultati, effettuare il BLAST tra la proteina in esame e la stessa proteina proveniente da altri organismi si ottengono così le sequenze più simili e di queste se ne possono osservare le analogie

6 VMD 3 Liceo scientifico tecnologico Istituto di Istruzione secondaria di II grado in lingua italiana Gandhi Merano (BZ) Scaricare la sequenza della proteina in esame in formato pdb dal sito aprire la pagina Name=VMD dalla quale è possibile scaricare il programma VMD, il quale, servendosi delle coordinate degli atomi contenute nel file pdb, crea un modello 3D che può essere visualizzato in varie modalità e di cui si potranno anche modificare le diverse impostazioni. aprire VMD dal terminale (applicazioni, accessori, terminale ) premere File successivamente New Molecule Browse caricare il file in formato pdb premere Load e la proteina verrà visualizzata inoltre le impostazioni di visualizzazione possono essere modificate a piacimento Es. per cambiare le impostazioni grafiche premere su Graphics Representations e modificare le impostazioni. Si ottiene così un'immagine simile a questa: (L'immagine rappresenta la proteina lactoglobulina. Per questa immagine si è scelto di utilizzare il metodo di rappresentazione CPK con colorazione in base all'elemento. I diversi colori, infatti, rappresentano i vari elementi, le sfere sono gli atomi e le linee che li uniscono rappresentano i legami).

7 Preparazione soluzioni Soluzioni, Diluizioni e reazione al Biureto Per preparare una soluzione in laboratorio è conveniente partire da una soluzione madre più concentrata e diluirla al momento dell'uso. In questo modo non sarà necessario pesare ogni volta la sostanza allo stato solido, ma basterà diluire opportunamente lo stock (soluzione madre) per ottenere la concentrazione necessaria. Preparazione delle soluzioni: si cerca di lavorare sempre con soluzioni di quantità maggiori di 50µl le soluzioni vanno preparate a catena: AB BC CD DE e cosi via Si parte con un'eppendorf, con 100µl di soluzione proteica con concentrazione (2g/l). con una soluzione di concentrazione pari a 2 g/l =2µg/µL inseriamo 10µg di proteina nel pozzetto (visto che la carica del pozzetto prevede 10µl di cui il 50% è soluzione proteica) Prepariamo altre Eppendorf mettendo 50 µl di acqua in ogni altra microprovetta e aggiungendo altri 50 µl di soluzione da quella precedente. 5µg/100µl 50µl + 50µl H 2 O 50µl + 50µl H 2 O 50µl + 50µl H 2 O 50µl + 50µl H 2 O Abbiamo sperimentato che il metodo a catena per diluire le soluzioni era il più efficace, senza cambiare puntale, per non perdere qualche microlitro, che poteva alterare la concentrazione della soluzione. Infatti, le prime volte costruendo la curva di calibrazione, curva che serve a calcolare la densità di concentrazione nelle diverse soluzioni, si notava che le concentrazioni non risultavano allineate. Nella preparazione a catena si inseriscono 50 µl d'acqua nelle Eppendorf e, usando sempre lo stesso puntale, si prendono dalla prima 50 µl della soluzione e si mettono nella seconda (aspirando e rilasciando la soluzione, con la micropipetta, per tre volte, per mescolare la soluzione nella provetta stessa e per prelevarne poi 50µl). Dalla seconda poi con lo stesso procedimento si passerà alla terza e cosi via. Per la preparazione delle soluzioni bisogna tenere conto della percentuale di proteina pura presente nella soluzione, Per esempio per la preparazione della soluzione di tripsina si è tenuto conto che il campione di partenza utilizzato era formato solo dal 15% da tripsina. Poiché nei pozzetti vanno inseriti 10µl, costituiti dal 50% di soluzione proteica e 50% di sample, è importante tenere conto di quanti microgrammi vengono inseriti nel gel

8 per l elettroforesi, ad esempio con una soluzione di concentrazione pari a 1 g/l =1µg/µL inseriamo 5µg di proteina nel pozzetto. I 10µl che vanno inseriti nei pozzetti sono composti da: 5µl di sample 5µl di soluzione proteica --> 5µl!1µg/µl = 5µg Metodo di Lowry Il metodo di Lowry punta a determinare la quantità presente di una proteina in una soluzione attraverso l'uso del Biureto (composto chimico di colore azzurro risultante dalla reazione di idrossido di sodio, tartrato sodico potassico e solfato di rame). La reazione porterà a una colorazione viola della nostra soluzione. L intensità della colorazione dipende dalla concentrazione delle proteine contenute nella soluzione. Il seguente protocollo illustra come determinare la quantità di tale proteina incognita presente in una soluzione proteica: Protocollo standard per l esecuzione dell analisi con biureto Lo standard e il campione incognito vanno preparati in modo da avere 2 ml finali in provetta (due provette per ogni standard e due provette per il campione incognito cioè in duplicato). Per la preparazione si può seguire il seguente procedimento: 1) preparare una soluzione madre da 100 mg/ml 2) da questa 100 µl µl di H 2 O in duplicato 3) preparare similmente le altre concentrazioni compreso il bianco ed i campioni incogniti 4) biureto: 0,6 gr CuSO4 1,8 gr NaK tartrato portare a 100 ml con NaOH 0,2M 5) ai 2 ml di soluzione proteica (standard e campioni) aggiungere 8 ml di biureto agitare e lasciare incubare per 20 min. 6) leggere l'assorbimento a 550 nm costruire la curva di calibrazione 550 nm in funzione della concentrazione mg/ml

9 protocollo Lo standard e il campione incognito vanno preparati in modo da avere 2 ml finali in provetta (due provette per ogni standard e due provette per il campione incognito cioè in duplicato). Per lo standard di albumina si può seguire il seguente procedimento: 1) preparare una soluzione madre da 100 mg/ml 2) da questa 100 µl µl di H 2 O in duplicato 3) preparare similmente le altre concentrazioni compreso il bianco ed i campioni incogniti 4) biureto: 0,6 g CuSO4 (0,94 g CuSO4 H 2 O) 1,8 g NaK tartrato (2,47 g NaK tartatrato per 4 H 2 O) portare a 100 ml con NaOH 0,2M 5) ai 2 ml di soluzione proteica (standard e campioni) aggiungere 8 ml di biureto agitare e lasciare incubare per 20 min. 6) leggere l'assorbimento a 550 nm la curva di calibrazione del BSA (Bovine Serum Albumin) 550 nm in funzione della concentrazione mg/ml SPETTROFOTOMETRO Lo spettrofotometro è uno strumento, che determina la concentrazione di una certa sostanza presente in una soluzione, analizzando la quantità di luce, che attraversa la soluzione stessa. Nel nostro caso abbiamo fatto reagire il biureto con la proteina, la quale, ha portato la soluzione ad assumere un colore violetto; a seconda della quantità di proteina presente, il colore appariva più scuro o più chiaro, inserendo le cuvette all'interno dello strumento, abbiamo ottenuto valori che esprimevano la concentrazione di tutte le proteine presenti nella soluzione, infatti questo metodo (metodo di Lowry) permette di analizzare il contenuto complessivo delle proteine presenti nella soluzione, ma non permette di distinguere le singole proteine. Standard I1 I0,5 I0,25 Bsa1,5 Bsa1 Bsa0,5 Bsa0,25 Bsa0,125 10µl 5µg 2,5µg 1,25µg 7,5µg 5µg 2,5µg 1,25µg 0,625µg I: soluzione incognita Bsa: Albumina da siero bovino

10 SDS-PAGE L'SDS-page (Sodium Dodecyl Sulphate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) è un procedimento di analisi proteica basato sull'elettroforesi su gels di poliacrilammide. L'SDS è un tensioattivo che denatura la proteina e si lega alla stessa in un rapporto costante (1,4 g di SDS per ogni grammo di proteina), conferendole una carica elettrica. La differenza di potenziale applicata ai gels durante l'elettroforesi permette una separazione tra le diverse proteine in base al loro peso molecolare, visto che il rapporto massa carica per ogni proteina denaturata rimane costante. Il procedimento per elettroforesi può essere schematizzato nel seguente modo: caricare celle preparare il running buffer (NECESSARI 700 ml per 2 vaschette, 500 ml per 1) riempire con buffer le vaschette (versare il buffer prima nelle due vaschette, fino a riempirle totalmente, poi versare il resto nella cella elettroforetica; non serve che si riempia tutta, basta che si bagni il fondo delle vaschette) caricare i pozzetti dei gel con 10 µl delle soluzioni proteiche e dello standard elettroforesi a 60 V per minuti (fino a quando le proteine superano lo stacking gel) elettroforesi a V fino a quando il colorante è sceso in fondo al gel Il protocollo di questa fase è particolarmente dettagliato ed ha richiesto diversi tentativi per la definizione corretta. La preparazione corretta dei gels richiede particolare attenzione e precisione Sostanze utilizzate: Tris-HCl (Il tris(idrossimetil)amminometano cloridrato) soluzione tampone per mantenere il ph costante APS (ammonio persolfato) iniziatore della polimerizzazione TEMED (tetrametiletilendiammina è il catalizzatore della reazione di polimerizzazione dell acrilammide. SDS (sodio dodecil solfato) tensioattivo (vedi sopra) Glicerolo necessario per appesantire la soluzione proteica e facilitarne la discesa nel pozzetto. Bromofenolo: colorante tracciante per la soluzione proteica. Ha dimensioni inferiori alle proteine e quindi è più veloce durante l elettroforesi. Quando il tracciante è uscito dal gel siamo sicuri che tutte le proteine sono migrate ( e si sono separate). DTT*(ditiotreitolo)*che*è*un*agente*riducente*che*rompe*i*legami*disolfuro*tra*cisteine

11 Protocollo Preparazione Separating Gel sufficiente per 4 gels (3,5 ml per ogni gel) 10,00% ddh 2 O (ml) 7,5 (ne abbiamo usati 7,4) 1,5 M Tris ph 8,8 (ml) 5 10% SDS (ml) (nostro SDS al 20% diluire del 50%) 0,2 30% Acryl/Bis (ml) 6,7 10% APS (µl) 100 (abbiamo raddoppiato a 200) TEMED (µl) 10 Stacking Gel sufficiente per 4 vaschette 4,00% ddh 2 O (ml) 3,05 0,5 M Tris ph 6,8 (ml) 1,25 10% SDS (ml) (nostro SDS al 20% diluire del 50%) 0,05 30% Acryl/Bis (ml) 0,65 10% APS (µl) 25 TEMED (µl) 5

12 Sample Buffer Alle soluzioni proteiche va aggiunto il sample buffer: la soluzione finale da inserire nei pozzetti sarà costituita al 50% dalla soluzione proteica e dal 50% dal buffer 1M Tris ph 6,8 (ml) 16 SDS (g) 1,2 (noi abbiamo usato 6 ml) 50% Glycerol (ml) 40 Bromo phenol blue (BPB) (mg) 10 (noi abbiamo usato 2,5 ml) ddh 2 O (ml) q.b per raggiungere 100 Al* sample* buffer* va* aggiunto* del* DTT*(ditiotreitolo)* che* è* un* agente* riducente.* Si* aggiunge* perché* riesce* a* rompere* i* legami* disolfuro* (S=S)* che* si* potrebbero* formare* tra* cisteine.* La* cisteina* è* un* aminoacido* che* in* ambiente* ossidante* può* legarsi* a* una* seconda* molecola* di* cisteina,*formando**un*ponte*disolfuro*=s=s=,*liberando*una*molecola*di*acqua.*questo*legame* tra*due*unità*di*cisteina*poste*in*punti*diversi*della*catena*polipeptidica*(o*su*due*polipeptidi* diversi)*può*causare*variazioni***delle*strutture*terziaria*e*quaternaria*della*proteina*stessa.** Pertanto* l aggiunta* del* DTT* al* sample* buffer* impedisce* la* formazione* di* eventuali* ponti* disolfuro.* La concentrazione di DTT (che abbiamo preparato con concentrazione 10 mm) è 10uL in 100uL (cioè una diluizione 1:10). Come preparare 4 gel: aggiungere le quantità secondo l'ordine della tabella per il SEPARATING GEL SENZA AGGIUNGERE IL TEMED!!! (ATTENZIONE: ricordarsi di diluire l'sds del 50% come riportato in tabella); versare la soluzione in una beuta per degassarla (max min); aggiungere il TEMED (ATTENZIONE: in questo momento inizia la polimerizzazione per creare il gel); PRIMA CHE LA SOLUZIONE GELIFICHI prendere una pipetta (micropipetta da 1000 µl) e aggiungere esattamente 3,5 ml di soluzione tra i vetrini precedentemente montati (ATTENZIONE: assicurarsi che la soluzione non fuoriesca SOTTO i vetrini). SEMPRE PRIMA CHE LA SOLUZIONE GELIFICHI livellarla in modo che il bordo superiore risulti una linea retta aggiungendo con la pipetta Pasteur dell'isopropanolo;

13 Una volta polimerizzato il gel, sciacquare l'alcool isopropilico con acqua distillata; preparare lo stacking gel seguendo la tabella sopra indicata (le quantità sono sufficienti per quattro gel, non bisogna degassare); VERSARE CON UNA PIPETTA PASTEUR LO STAKING GEL FINO AL BORDO AGGIUNGERE I PETTINI PRIMA CHE GELIFICHI LA SOLUZIONE (non importa se un po' della sostanza fuoriesce al momento dell'inserimento). Una volta polimerizzata la soluzione, montare le vaschette dentro la cella elettroforetica in modo che i vetrini siano a tenuta stagna e che il Running Buffer non fuoriesca dal fondo (il running buffer contiene Tris base, SDS e Glicina). Il running buffer verrà versato sia tra i vetrini (fino all'orlo), sia all'interno della cella elettroforetica, in modo che i gels siano a contatto con il buffer sul fondo della cella. Il running buffer viene precedentemente preparato diluendo dieci volte il nostro prodotto (50 ml del buffer con 450ml di acqua). Sono necessari 500 ml per una vaschetta, 700 ml per due. Riempire il primo pozzetto con 10 µl di standard; successivamente riempire gli altri pozzetti con 10 µl delle varie soluzioni a concentrazione diversa (contenenti 5 µl di soluzione proteica e 5 µl di sample buffer). IMPORTANTE: scrivere l'ordine di inserimento delle varie sostanze nei pozzetti del gel. Chiudere la cella, assicurandosi che il colore degli elettrodi del coperchio coincida con quelli della cella elettroforetica. Accendere il generatore impostato su 60 V per minuti, la bassa tensione è necessaria perché le soluzioni attraversino lentamente lo stacking gel. Alzare quindi il valore della tensione a V fino a quando il colorante non sia giunto in fondo al gel. Estrarre il gel dal vetrino con il gel releaser, sciacquarlo delicatamente con acqua demineralizzata e metterlo in una vaschetta con del colorante (GelCode Blue). Lasciare il gel a incubare nel colorante per 24 ore e infine risciacquare e lasciare il gel in ammollo per alcune ore in acqua distillata. A questo punto il gel è pronto per essere analizzato. Nel caso le bande non fossero sufficientemente visibili si può procedere ad una colorazione supplementare.

14 Analisi del Gel Lo standard che viene caricato in uno o due pozzetti del gel ci permette immediatamente di risalire al peso molecolare delle proteine corrispondenti ad una precisa banda. Ad esempio nel gel le colonne da destra a sinistra corrispondono a: Standard HSA 0,625µg HSA 1,25 µg HSA 2,5 µg HSA 5 µg HSA 7,5 µg Sol.Inc. 1,2 µg 5 Sol.Inc. 2,5 µg Sol.Inc. 5 µg Standard HSA > human serum albumin Sol.Inc. > Soluzione Incognita Nel gel è chiaramente visibile una banda in basso nelle tre colonne delle soluzioni incognite che coincide con una banda del nostro standard. Tale banda coincide con i 18,4 kda, che corrisponde esattamente al peso molecolare della lactoglobulina. Per l analisi dei gel utilizziamo un programma (free-share): ImageJ, che ci permette di effettuare un analisi densitometrica delle bande che ci interessano. Selezionando le bande della foto o scan del gel, possiamo calcolarne la densità, in seguito possiamo ottenere il plot (grafico), del quale possiamo misurare l area dei picchi.

15 In seguito le misure ottenute possono essere inserite in un foglio di calcolo (Excell, Logger Pro) per ottenere una retta di calibrazione, che può essere utilizzata per trovare la concentrazione delle sostanze incognite. Alcuni dati possono essere esclusi per avere una curva di calibrazione migliore, ad esempio i valori corrispondenti alla banda 6 del gel in esame risultano fuori scala e quindi è meglio eliminarli durante la costruzione del fit. I dati che abbiamo ottenuto dall'analisi ultimata corrispondono alla quantità percentuale (circa 60%) di lactoglobulina presente nel campione (ricordiamo che la lactoglobulina coincide con la banda più visibile nel gel e corrisponde al picco dei plot che abbiamo selezionato).

16 Aprire il programma ImageJ Selezionare File ---> Open, e aprire la foto o scan del gel da analizzare. protocollo Selezionare Rectangular Selections, quindi selezionare un area che abbia il colore dello sfondo Cliccare su Process ---> Subtract Backgroung. Lasciare le impostazioni della finestra che si aprirà come le predefinisce il programma e cliccare ok. Ora cliccare su Rectangular Selections e creare un rettangolo della dimensione della banda più larga In seguito cliccare Ctrl 1 per selezionare la prima banda, oppure cliccare su Analyze ---> Gels ---> Select First Lane Eseguire lo stesso procedimento con le bande successive cliccando però Ctrl 2, oppure cliccare su Analyze ---> Gels ---> Select Next Lane. Continuare il procedimento con le bande seguenti cliccando Ctrl 2 o selezionando Select Next Lane. Selezionare tutte le bande interessate, cliccare Ctrl 3, oppure Analyze ---> Gels ---> Plot Lanes, per ottenere il plot, cioè il grafico della densità. Ottenuto il grafico (plot) tracciare con lo strumento Straight (linea) delle rette alla base di ogni picco, in modo da delimitarne l area. Utilizzando poi lo strumento bacchetta magica ( Wand Tool ) e cliccando con esso all interno del picco, verrà misurata l area. Si aprirà una finestra (Results) con i dati delle aree dei picchi, che potrà essere salvata. Questi dati andranno inseriti nel Template nella colonna Area della parte verde, mentre i dati delle concentrazioni in microgrammi nella colonna Concentrazioni della parte verde. A questo punto dal grafico si dovranno riportare i valori di m e q della retta di calibrazione ottenuta nel Template. A questo punto, se si inseriscono i valori delle aree dei plot delle soluzioni incognite negli spazi appositi si osserveranno automaticamente le concentrazioni delle sostanze incognite. *

17 Conclusione La messa a punto dei protocolli ha richiesto una serie di tentativi, non sempre riusciti, a volte per piccole ma irrimediabili distrazioni le esperienze non ottenevano risultati apprezzabili: al primo tentativo la poliacrilammide ha richiesto otto ore per polimerizzare al secondo tentativo la poliacrilammide ha polimerizzato nella pipetta Pasteur durante la fase di riempimento dei vetrini successivamente, messo a punto il protocollo per la preparazione dei gels, le concentrazioni delle proteine non risultavano corrette alcune proteine che abbiamo utilizzato risultavano essere degradate lo standard che abbiamo in dotazione risulta parzialmente degradato La difficoltà di reperire una proteina pura o con concentrazione nota: dopo aver richiesto a tutte le farmacie dei campioni che però risultavano sempre dei miscugli di proteine diverse, ne abbiamo reperito qualche milligrammo presso l Eurac di Bolzano, (i ricercatori si sono immediatamente resi disponibili alla nostra richiesta) e molti altri problemi ancora. Il progetto Lars-Biotec però è proprio questo, un laboratorio dove si fa esperienza di ricerca, con tutti i problemi annessi, con la routine della sperimentazione, con processi di problem solving reali. Abbiamo ottenuto comunque un ottimo risultato finale, in cui tutte le nostre analisi coincidevano con le informazioni dei prodotti analizzati in nostro possesso. Certo la sperimentazione non finisce nemmeno dopo un buon esito, infatti, per un analisi migliore, dovremmo cambiare la tessitura del nostro gel, aumentando la percentuale di acrilammide in modo da distendere le bande della nostra soluzione incognita (ormai non più incognita) su un area maggiore del gel e quindi ingrandire la parte interessante del nostro gel, per distinguere magari bande che in questa nostra prima analisi possono essere sovrapposte L esperienza della ricerca estende la ricerca di esperienza.