DOSAGGIO ACIDI NUCLEICI

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1 DOSAGGIO ACIDI NUCLEICI

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15 l Cuvetta contenente il campione di proteina a concentrazione C Sorgente I 0 I 1 I 0 Rivelatore Quando si fa passare una luce di una particolare lunghezza d onda d λ attraverso un percorso l di una soluzione di concentrazione definita, una certa proporzione della luce è assorbita dalla soluzione. Se l energia l della luce incidente è I 0 e l energia l della luce trasmessa (dopo essere passata attraverso la soluzione) è I 1, allora la frazione di luce trasmessa è I 1 /I 0, nota come trasmittanza T. Se T = 100%, la sostanza è trasparente. Se T = 0%, la sostanza è opaca ed assorbe completamente la luce.

16 L assorbanza di una soluzione è direttamente proporzionale alla concentrazione del materiale assorbente quando il percorso della luce è mantenuto costante. A = log 10 (I 0 /I 1 ) = εcl coefficiente di estinzione L assorbanza è adimensionale. Quando la concentrazione è espressa in molarità (M) ed il percorso della luce in centimetri (cm), ε è noto come coefficiente di estinzione molare (M - 1 cm - 1 ) di un dato composto. ε 0.1% 280nm è l assorbanza a 280 nm di una soluzione allo 0.1% (1 mg/ml) della sostanza in esame (ad es. una proteina) in una cuvetta lunga 1 cm.

17 La concentrazione delle proteine può essere stimata misurando l assorbanza delle soluzioni contenenti le proteine a 280 nm (UV) Il metodo è adoperato comunemente perché non distrugge il campione ed è molto rapido La maggior parte delle proteine ha un massimo di assorbimento a 280 nm per la presenza degli amminoacidi aromatici triptofano (W), tirosina (Y) e fenilalanina (F) Poiché la composizione in amminoacidi delle proteine varia notevolmente, l assorbimento molare varierà anch esso di molto, a seconda del contenuto di questi amminoacidi Proteine che non contengono W, Y e F non avranno un massimo di assorbimento a 280 nm,, mentre proteine che contengono molti residui di W, Y e F avranno elevati valori di assorbimento molare, con un massimo di assorbimento a 280 nm. Il metodo non è quindi molto accurato a meno che la proteina sia pura e ne sia noto l assorbimento molare.

18 O O O H 2 N CH C OH H 2 N CH C OH H 2 N CH C OH CH 2 CH 2 CH 2 HN Trp (Triptofano) OH Tyr (Tirosina) Phe (Fenilalanina)

19 Determinazione della concentrazione proteica mediante spettrofotometria Spettro di assorbimento UV-VIS VIS di una proteina Assorbimento Picco di assorbimento di Tirosine, Triptofani e Fenilalanine Lunghezza d onda d λ (nm) UV = 200 nm 350 nm

20 Necessità di utilizzare cuvette di quarzo A meno che la proteina non sia libera da altri composti che assorbono luce a 280 nm,, i risultati saranno poco accurati Gli acidi nucleici sono particolarmente fastidiosi perché gli anelli purinici e pirimidinici hanno massimi di assorbimento vicini a 260 nm,, con un assorbimento considerevole che si estende fino a 280 nm Se gli acidi nucleici sono gli unici contaminanti, la concentrazione della proteina può essere stimata adoperando una formula che corregge ragionevolmente bene per il contenuto in acidi nucleici: [proteina] (mg/ml) = 1,55 A 280 0,76 A 260

21 Non è distruttivo Consente misure in continuo, ad esempio su un eluente di una colonna cromatografica Il limite di sensibilità può essere aumentato in maniera significativa misurando i massimi di assorbimento a lunghezza d onda d comprese tra 190 e 220 nm

22 Il reattivo del biureto è costituito da una soluzione di solfato di rame alcalino contenente potassio tartrato di sodio In condizioni alcaline gli ioni rameici Cu 2+ formano un complesso di coordinazione con quattro gruppi NH presenti in altrettanti legami peptidici Il complesso che si forma assorbe luce nel visibile, con un picco a 550 nm R O N N Cu CU+2 2+ Cu N N O R

23 Essendo basato sull interazione degli ioni rameici con i legami peptidici, il metodo è universabile e molto riproducibile Scarsa sensibilità: : il metodo non si dimostra infatti adatto alla determinazione di concentrazioni inferiori ad 1 mg/ml Interferenza da parte dei sali ammonici: inutilizzabile su campioni proteici ottenuti per precipitazione con ammonio solfato perch rché questi campioni contengono alte concentrazioni di ammonio

24 Consiste nella reazione del biureto,, seguita dalla riduzione in condizioni alcaline del reagente di Folin-Ciocalteu (acidi misti di fosfomolibdotungstato) Gli ioni di rame facilitano il processo di riduzione I gruppi cromogeni principali sono i legami peptidici complessati con rame (biureto)) ed i molibdotungstati ridotti blu, che sono ridotti in gran parte da tirosina, triptofano ed amminoacidi polari Il prodotto della reazione, eteropolimolibdeno,, ha una forte colorazione blu, con un massimo di assorbimento a circa 750 nm

25 Poco costoso Di facile esecuzione Altamente riproducibile Molto sensibile: è possibile determinare concentrazioni fino a 10 µg/ml E soggetto ad interferenze da parte di una varietà di sostanze, quali Tris, HEPES ed EDTA Le curve standard sono lineari solo a basse concentrazioni proteiche Sono necessari tempi di incubazione precisi per ottenere dati riproducibili La reazione dipende dal ph ed è necessario avere un ph compreso tra 10 e 10.5

26 Recentemente sono stati introdotti un certo numero di reagenti alternativi per la determinazione degli ioni rameici, i quali consentono di effettuare un saggio più conveniente e riproducibile

27 La reazione del BCA (acido bicinconinico) è simile a quella del reattivo di Lowry Cu +2 è ridotto a Cu +1 dalle molecole proteiche in soluzione alcalina Due molecole di BCA chelano uno ione rameoso (Cu +1 Tale evento determina la formazione di un intenso colore violetto to con un massimo di assorbimento a 562 nm +1 )

28 Proteina + Cu +2 OH - Cu +1 - OOC N N COO - Cu BCA +1 Cu - OOC N N COO -

29 Sensibilità simile a quella del metodo di Lowry (10 µg/ml) Ridotta suscettibilità alla presenza di detergenti Dopo un incubazione di 30 minuti a 37 C il colore è sufficientemente stabile per misurazioni attendibili (spostamento del 2,5% in 10 minuti) Il colore continua a svilupparsi lentamente nel tempo Interferenza da parte di carboidrati Ecco un elenco di una parte delle sostanze che interferiscono con il metodo BCA: catecolamine, triptofano, lipidi, rosso fenolo, cisteina, tirosina, saccarosio, glicerolo non puro,, H 2 O 2, acido urico e ferro.

30 Il legame del colorante Coomassie Brilliant Blue G-250 alle proteine determina uno spostamento del massimo di assorbimento del colorante c da 465 nm (rosso) a 595 nm (blu) in soluzioni acide (Bradford( Bradford,, 1976) Tale colorante forma forti complessi non covalenti con le proteine tramite interazioni elettrostatiche con gruppi aminici e carbossilici e tramite forze di van der Waals Il colorante è preparato come soluzione stock in acido fosforico Il metodo è un semplice procedimento costituito da un unico passaggio in cui il colorante è aggiunto ai campioni e si determina l assorbanza l a 595 nm

31 OCH 2 CH 3 Coomassie Brilliant Blu R HN N SO 3 Na N+ SO 3 Na La quantità di colorante che si lega è proporzionale alla quantità di proteina presente in soluzione. Pertanto l intensitl intensità del colore blu (e dunque l assorbimento) l è proporzionale alla concentrazione proteica. In genere quantità uguali di proteine differenti legano la stessa quantità di colorante il saggio è indipendente dal tipo di proteina

32 Poiché l intensità della colorazione non è lineare in una vasta gamma di concentrazioni di proteine, si raccomanda fortemente di preparare una curva standard per ogni saggio. 1 mg/ml 2 mg/ml 4 mg/ml 8 mg/ml 16 mg/ml X mg/ml

33 µg g di proteina Intensità del colore blu Assorbanza a 595 nm

34 Semplicità di preparazione del reattivo Sviluppo del colore immediato Stabilità del complesso Elevata sensibilità (fino a 22 µg/ml) Il saggio è compatibile con la maggior parte dei tamponi comuni, degli agenti denaturanti come guanidina HCl 6M e urea 8 M e dei preservanti come sodio azide Il reagente colora le cuvette ed è piuttosto difficile da rimuovere La quantità di colorante che si lega alla proteina dipende dal contenuto in aminoacidi basici ciò rende difficile la scelta di uno standard Molte proteine non sono solubili nella miscela di reazione acida

35 Kjeldahl Method --- Nitrogen Determination (1) Digestion + conc. H2SO4 + a catalyst nitrogen converted into an ammonium ion. (2) Neutralize to get NH3 with NaOH (3) Steam distillation of NH3 and trap in boric acid. (4) Titrate with hydrochloric acid. Calculation: Gram nitrogen/ gram of sample = *(ml of sample - ml of blank) N standard acid 0.014g/meq weight of sample * ml of hydrochloric acid required to titrate sample solution.

36 Disadvantages: not all N is protein. Purine Pyrimidine DNA, RNA, etc. Urea Many plant tissues have > 50% non-protein N. % N 6.25 = % Protein