BIOCHIMICA e BIOTECNOLOGIE degli ALIMENTI

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1 Seconda Università degli Studi di Napoli DiSTABiF Anno Accademico Corso di Laurea Magistrale in SCIENZE DEGLI ALIMENTI E DELLA NUTRIZIONE UMANA Insegnamento di BIOCHIMICA e BIOTECNOLOGIE degli ALIMENTI Prof. Augusto Parente Lezione 32

2 DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE PROTEICA TOTALE Metodo Kjeldahl Per lunghi anni, la quantità di proteine (proteina grezza) di alimenti è stata determinata calcolando il contenuto di AZOTO totale. Il metodo Kjeldahl è il metodo di elezione per la determinazione del contenuto di AZOTO. Questo valore viene poi moltiplicato per un fattore per ottenere la quantità di proteine. Questo metodo si basa su due assunzioni: i) carboidrati e grassi alimentari non contengono azoto; ii) la quasi totalità dell azoto presente negli alimenti deriva dagli amminoacidi delle proteine. Sulla base delle prime determinazioni, il contenuto medio di N nelle proteine era di circa il 16% (160 g/1000 g), che ha portato all uso del calcolo Nx6,25 (1/0,16= 6,25). Tuttavia non tutto l azoto che si può titolare è presente nelle proteine, ma anche in amminoacidi liberi, nucleotidi, creatina e colina.

3 Inoltre, il contenuto di azoto di alcuni amminoacidi (come % in peso) varia in relazione al peso molecolare dell amminoacido ed al numero di atomi di azoto in essi contenuti [da uno a quattro a seconda degli amminoacidi: tutti uno ad eccezione di Lys e Gln/Asn (2), His (3), Arg (4)]. Sulla base di queste considerazione, in realtà il contenuto di N nelle proteine varia da 5,26 (1/0,19) a 7,69 (1/0,13).

4 Gli attuali fattori sono riportati nella seguente Tabella Origine Alimento Fattore Origine Alimento Fattore Animale Uova 6,25 Vegetale Grano Chicco intero 5,83 Carne 6,25 Crusca 6,31 Latte 6,38 Endosperma 5,70 Vegetale Orzo 5,83 Ricino 5,30 Mais 6,25 Fagioli (vari tipi) 6,25 Miglio 5,83 Soia 7,71 Avena 5,83 Noccioline 5,46 Riso 5,95 Segale 5,83 Sorgo 6,25

5 Metodo Kieldhal (1) Digestione + H 2 SO 4 concentrato + catalizzatore -> azoto convertito in ione ammonio. (2) Neutralizzare con NaOH per ottenere NH 3 (NH 4+ ) (3) distillare NH 3 (NH 4+ ) e intrappolare in acido borico. (4) Titolare con acido cloridrico.

6 Espressione dei risultati Calcolare il contenuto di sostanze azotate per 100 g di sostanza secca (s.s.) con la formula: V x N x F x Sostanze azotate % s.s. = E x (100 - U) dove: V = ml di acido 0,1 N (6.9); N = 0, (grammi di azoto corrispondenti a 1 ml di acido 0,1 N); E = peso del campione in grammi; U = umidità percentuale del campione; F = fattore di conversione dell'azoto in sostanze azotate, uguale a: 5,70 per grano e segale; 5,95 per riso; 6,25 per mais e orzo. Il fattore 6,25 viene anche usato nelle etichette nutrizionali e per i prodotti cerealicoli in miscela.

7 Metodo Kjeldhal SVANTAGGI: Non tutto l azoto viene dalle proteine: Purine Pirimidine DNA, RNA, ecc. Urea Altre sostanze aggiunte intenzionalmente (FRODI)

8 UREA MELAMMINA nel latte

9 Per la determinazione della concentrazione di proteine parzialmente purificate sono disponibili molti metodi. Parecchi di essi non forniscono un concentrazione assoluta ma relativa rispetto ad uno stock di proteina standard che viene usata per la preparazione di una retta di taratura (per il basso costo, la facile reperibilità, etc., si utilizza come standard l albumina da siero bovino, o BSA). Il Metodo Si costruisce innanzitutto una retta di taratura con quantità crescenti di albumina da siero bovino (BSA) utilizzata come riferimento. Vengono anche preparati un campione che non contiene BSA (detto bianco) e due aliquote (in L) del campione cx.

10 n. provetta BSA 2 mg/ml (1 L= 2 g) BSA presente Campione X ( L) H 2 O ( L) Reagente ( L) 0 (bianco) CX CX I campioni si incubano per un determinato tempo, poi...

11 595 nm 1- Lettura dei campioni, incluso il bianco; 2- costruzione della retta di taratura, con i campioni di BSA, utilizzando le letture a 595 nm, sottratte del valore del bianco; 3- interpolazione dei valori di assorbimento, anch essi sottratti del valore del bianco, dei campioni proteici a [X] (in doppio); 4- lettura sull ascissa della quantità di Lowry Assay Standard Curve Protein amount vs. Absorbance g proteine contenuta nel campione X (esprimendo la concentrazione in mg/ml ) A a Protein ( g) L intensità di colore aumenta all aumentare della quantità di proteine (osservazione qualitativa); La lettura dell assorbimento ed il ricorsi della retta di taratura ci fanno avere la QUANTITÀ di proteine (dato quantitativo).

12 Metodo del biureto Il reagente chiave è una soluzione fortemente alcalina di tartrato contenente solfato di rame(ii) diluito. Quando la soluzione è aggiunta alla proteina, il rame si può legare alle proteine, formando un complesso colorato (si ritiene che tale complesso includa la coordinazione contemporanea di 4 gruppi peptidici con un unico ione rame). Compare un colore viola-bruno ( max =540 nm) che ovviamente sarà proporzionale alla concentrazione totale dei legami peptidici e dunque di proteina. Biureto Si forma riscaldando l'urea a C. Reagisce con la soluzione fortemente alcalina di tartrato contenente solfato di rame(ii) diluito. Da ciò deriva il nome dato al metodo.

13 O H R O H N N Cu 2+ N N H O R H O Complesso formato dal rame, con colore viola-bruno Il metodo è generale (anche se i residui di prolina non reagiscono ) e molto riproducibile. Purtroppo, la sensibilità è bassa: non consente in genere di misurare concentrazioni proteiche <1 mg/ml.

14 METODO DI LOWRY (CON IL REATTIVO DI FOLIN-CIOCALTEAU) Molto usato, soprattutto nel passato. La miscela da saggiare viene dapprima portata in ambiente alcalino (ph ) e fatta reagire con citrato o tartrato di rame(ii). Dopo un certo tempo (necessario probabilmente per consentire la complessazione del rame da parte delle proteine) si aggiunge la miscela di Folin- Ciocalteau (sviluppato inizialmente per la determinazione della tirosina e quindi poi per fenoli e polifenoli), il cui componente attivo è rappresentato da una miscela di sodio molibdato, fosfato e tungstato. Con l andare del tempo si sviluppa un colore scuro, che tende al blu in presenza di proteina (in assenza, il colore tende al marrone). L intensità della colorazione blu (lettura a 660 nm), sarà proporzionale alla concentrazione di proteina.

15 Non è chiaro perché il colore blu si sviluppi, è possibile che gli acidi fosfomolibdotungstici formino dei complessi misti con rame e proteina. Poiché la presenza e quantità dei residui aromatici (in particolare, tirosinici) influenzano fortemente per lo sviluppo del colore, sembra più probabile che il meccanismo coinvolga una riduzione dello ione Cu 2+ a Cu + da parte di questi residui, seguita da una reazione dello ione rameoso con gli acidi fosfomolibdotungstici. Svantaggi: richiede tempi di incubazione precisi; inoltre alcuni tamponi (come il MES) ed altre sostanze possono interferire; infine, poiché il contenuto in tirosine può influenzare la colorazione, le risposte al saggio possono variare abbastanza a seconda del tipo di proteine presenti.

16 IL solo REATTIVO di Folin-Ciocalteau è molto utilizzato per la determinazione dei POLIFENOLI TOTALI nelle matrici alimentari: frutta e verdura (pomodoro), tè verde, tè nero, vino rosso, caffè, cioccolato, olive e olio extra vergine di oliva (per citare solo alcuni dei componenti della dieta mediterranea); etc; I POLIFENOLI sono delle particolari molecole che, in base alla loro struttura chimica, possono essere suddivisi in tre diverse classi principali: i) fenoli semplici; ii) flavonoidi; iii) tannini. I fenoli semplici comprendono gli acidi benzoici, le cumarine, gli acidi fenolici, e possono essere trovati in molti cibi e bevande, come per esempio nel caffè. I tannini si suddividono in due categorie: i condensati e gli idrolizzatili. I flavonoidi rappresentano la tipologia di fenoli più grande in natura. e, a seconda della loro composizione, si raggruppano essenzialmente in: flavoni, flavonoidi, antociani, e isoflavoni.

17 Il Reattivo è costituito da una miscela di acido fosfotungstico (H 3 PW 12 O40) e acido fosfomolibdico (H 3 PMo 12 O 40 ). Per reazione con i fenoli, questi acidi si riducono a ossidi di tungsteno e molibdeno (W 8 O 23 e Mo 8 O 23 ) dal tipico colore blu, con un massimo d'assorbimento a 750 nm. Contenuto di polifenoli totali in alcuni alimenti Succo d uva g polifenoli totali /ml di succo Varietà di mele Da 0,1 g polifenoli totali / kg peso fresco a 10 g / kg in alcune varietà di mele da sidro

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20 Metodo dell acido bicinconinico BCA- un saggio molto simile a quello di Lowry, con la differenza che il rame(ii) anziché in associazione con il reagente di Folin-Ciocalteau si usa in associazione con l acido bicinconinico. Si ritiene che la riduzione dello ione Cu 2+ a Cu + sia qui seguita dall associazione dello ione rameoso con l acido, con formazione di un complesso che assorbe fortemente a 562 nm (colore viola-blu). Il saggio presenta la stessa variabilità da proteina a proteina già vista per il Lowry, ma è più riproducibile e un po più sensibile. N N O- O O- O Acido bicinconico

21 Metodo di Bradford Si basa sull interazione non-covalente di un colorante (il Coomassie Brilliant Blue R-250) con le proteine. Il saggio viene effettuato a ph acido. Il colorante si lega primariamente ai residui basici ed aromatici, e la formazione di questi complessi determina uno spostamento del massimo di assorbimento del colorante da 465 a 595 nm, che può essere misurato spettrofotometricamente. Anche se diverse proteine possono dare risposte alquanto diverse in questo saggio, la sua semplicità ed elevata sensibilità (<0.1 mg/ml) fa sì che sia largamente usato. Il Coomassie Blue si usa anche per evidenziare le bande proteiche nella gel elettroforesi. Coomassie Brilliant Blue R-250

22 Silver staining Questa tecnica è usata normalmente per colorare proteine nella gel elettroforesi, nel caso sia richiesta una elevata sensibilità. Assorbimento nel vicino UV La presenza degli anelli aromatici di tirosina e triptofano fa sì che le proteine presentino un assorbimento di luce nel vicino ultravioletto, con massimo a circa 280 nm. Il coefficiente di estinzione molare varia ovviamente da proteina a proteina (dipende dal numero e dalla posizione degli amminoacidi aromatici), ma in genere può essere calcolato con buona approssimazione partendo dalla sequenza amminoacidica. Va tenuto presente che molte altre sostanze possono assorbire nel vicino ultravioletto, e quindi condizionare i risultati della misura; fra queste gli acidi nucleici, che però hanno un massimo di assorbimento a 260 nm. A volte, nelle prime fasi di purificazione di una proteina, può essere utile verificare il rapporto tra gli assorbimenti a 280 e 260 nm, per verificare se e quanto una data frazione di proteina sia contaminata da acidi nucleici.

23 L assorbimento ultravioletto 280 nm: Può rappresentare un ottima tecnica quando non si ha alcuna idea della concentrazione di un campione che deve essere assolutamente recuperato. Si usa in genere prima di passare a metodi più precisi e sensibili; La determinazione si basa sull assorbimento specifico degli aminoacidi aromatici tirosina e triptofano; La misura è soggetta a interferenza da altri componenti cellulari e in particolare acidi nucleici; Il metodo non è molto sensibile e presuppone l uso di cuvette di quarzo; Il vantaggio reale è che il campione non viene distrutto e la misura è molto rapida.

24 1. Azzerare lo spettrofotometro con acqua o tampone 2. Misurare l assorbimento a 280 nm in cuvette di quarzo 3. Cambiare lunghezza d onda a 260 nm, fare lo zero con acqua o tampone 4. Misurare l assorbimento a 260 nm in cuvette di quarzo 5. Usare la seguente equazione per calcolare la concentrazione proteica [Proteina] (mg/ml) = 1.55*A *A260

25 DETERMINAZIONE DELLA COMPOSIZIONE AMMINOACIDICA DELLE PROTEINE ALIMENTARI Amminoacidi essenziali e Qualità proteica La determinazione della composizione amminoacidica* delle proteine alimentari prevede le seguenti fasi: 1- Idrolisi delle proteine 2- Separazione e identificazione degli amminoacidi 3- Quantizzazione degli amminoacidi *COMPOSIZIONE AMMINOACIDICA: quali dei venti amminoacidi sono presenti nelle proteine ed in che quantità.

26 1- IDROLISI DELLE PROTEINE 1- NELLE PROTEINE, COME È NOTO, gli amminoacidi sono uniti tra loro mediante il legame peptidico. Pertanto, per poterli separare e identificare, bisogna rompere il legame peptidico. Questo si può fare mediante una idrolisi CHIMICA oppure ENZIMATICA. IDROLISI CHIMICA: l idrolisi si effettua in presenza di HCl 6M, a 110 C per un tempo di ore In queste condizioni l idrolisi è completa. Tuttavia, alcuni amminoacidi possono subire delle modifiche o parziale idrolisi: - Thr, Ser e Tyr subiscono delle perdite parziali - Trp viene distrutto - Cys e Met possono in parte ossidarsi - Val e Ile richiedono una idrolisi a 72 ore, quando nella sequenza sono tra loro legati; - Le ammidi asparagina e glutammina vengono trasformate nei relativi amminoacidi.

27 Naturalmente, la determinazione del contenuto preciso riguarda gli amminoacidi essenziali (9): Thr, Val, Ile, Leu, Met, Lys, Phe, Trp, His (e Arg nei bambini) -Thr: Il suo contenuto viene corretto del 5% (in più) rispetto al contenuto calcolato a 24 h; - Val ed Ile vengono calcolate a 72 ore; -il Trp viene ottenuto dopo idrolisi basica con NaOH oppure con idrolisi acida con acido mercaptoetansolfonico; -Met subisce meno perdite se nella soluzione di idrolisi si aggiunge un agente protettore (tiodiglicole, fenolo); - Lys, Leu, His, Arg e Phe sono amminoacidi stabili e non richiedono particolari attenzioni.

28 IDROLISI ENZIMATICA L idrolisi enzimatica permette di evitare la distruzione degli amminoacidi, precedentemente riportati, ma rischia di essere incompleta. Tuttavia, essendo basata su enzimi dello stesso tipo di quelli utilizzati in vivo, questa tecnica libera solo gli amminoacidi effettivamente idrolizzabili durante la digestione. Per questo si ritiene che essa sia in grado di fornire la frazione di amminoacidi DISPONIBILI o UTILIZZABILI.

29 2- SEPARAZIONE E IDENTIFICAZIONE DEGLI AMMINOACIDI Dopo aver idrolizzato le proteine in modo opportuno, si passa alla separazione ed alla identificazione degli amminoacidi. -Il Trp si può determinare, senza separazione, utilizzando il metodo della triptofanasi, come in precedenza discusso. Per gli altri amminoacidi si possono applicare 1- Metodi di derivatizzazione pre-colonna seguiti dalla separazione; 2- Oppure metodi di derivatizzazione post-colonna, in cui si ha prima la separazione e poi la colorazione degli amminoacidi. Nel primo caso si utilizzato reagenti quali fenilisotiocianato, o- ftalaldeide, reattivo di Sanger (2,4 dinitrofluorobenzene), etc. I derivati degli amminoacidi ottenuti vengono separati mediante RP-HPLC, identificati utilizzando condizioni standard e separazioni di riferimento e quantizzati.

30 Nel secondo caso si utilizzano TECNICHE BASATE SULLE PROPRIETA DI CARICA: LA CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO Questa è la procedura che meglio si adatta alla separazione di amminoacidi proteici. Il principio su cui si basa è l instaurarsi di legami elettrostatici tra le molecole da separare e gruppi carichi presenti sul supporto cromatografico. Il supporto generalmente utilizzato per la separazione di amminoacidi è un polimero di stirene/divinilbenzene che, per essere utilizzato come scambiatore di ioni, viene modificato con l introduzione di gruppi solfonici, carichi negativamente (polivinilbenzene solfonato). SCAMBIATORI IONICI FORTI : Hanno gruppi ionizzabili che ritengono la loro carica ionica in quasi tutto l intervallo di ph (1-13). SCAMBIATORI IONICI DEBOLI Hanno gruppi ionizzabili solo in uno stretto intervallo di ph.

31 Polistirene/divinilbenzene CROMATOGRAFIA A SCAMBIO CATIONICO CH-CH 2 -CH-CH 2 -CH-CH 2 -CH-CH 2 SO 3 SO 3 SO 3 SO 3 POLIVINILBENZENE SOLFONATO

32 SCHEMA DELLA CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO

33 FASI DELLA CROMATOGRAFIA A SCAMBIO ANIONICO FASE 1: LEGAME ALLA RESINA: Una miscela di amminoacidi, disciolta in un tampone acido a ph 2,2, viene caricata su di una colonna cromatografica contenente la resina. In tali condizioni tutti gli amminoacidi possiedono una carica netta positiva e si legano con legame ionico alla resina Campione contenente diversi amminoacidi Colonna di eluizione contenente particelle di resina a scambio anionico

34 FASE 2: ELUIZIONE degli AMMINOACIDI: Il distacco selettivo degli amminoacidi viene effettuato facendo passare attraverso la colonna cromatografica una soluzione tampone a ph e forza ionica crescenti. Può anche essere aumentata la temperatura della colonna L incremento di forza ionica, ottenuto aumentando la concentrazione salina dell eluente, tenderà ad indebolire i ponti salini stabilitisi tra amminoacidi e resina; L aumento di ph porterà ad una graduale deprotonazione dei gruppi acido-basici presenti sulla catena laterale. Alcuni amminoacidi tenderanno ad assumere così carica netta zero interrompendo il legame ionico con la resina e passando nell eluente per poi emergere dalla colonna cromatografica. Quanto più basso è il punto isoelettrico di un amminoacido, tanto più facilmente l aumento di ph e forza ionica porterà alla sue eluizione. L aumento della temperatura della colonna ha un effetto simile.

35 FASI CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO

36 FASE 2: Il processo di separazione separa gli amminoacidi in bande discrete L eluato che esce dalla colonna viene raccolto Alcune frazioni non contengono amminoacidi

37 FASE 3: COLORAZIONE. L eluente, raccolto in differenti provette, è poi sottoposto alla reazione con ninidrina per rilevare la presenza di amminoacidi. Questa procedura può essere automatizzata in un apparecchio detto analizzatore di amminoacidi.

38 DIAGRAMMA DI FLUSSO DI UN ANALIZZATORE DI AMMINOACIDI

39 Assorbimento a 570 nm CROMATOGRAMMA DI IDROLIZZATO PROTEICO Tempo (minuti)

40 - ph dell eluente - Forza ionica dell eluente - Temperatura della colonna - Flusso dell eluente Se questi parametri sono fissi e controllati: -Il tempo di eluzione permette di identificare un certo amminoacido - L area del picco permette di determinare la quantità di amminoacido, in riferimento ad un cromatogramma ottenuto caricando quantità NOTE di ciascun amminoacido (CALIBRAZIONE) La calibrazione permette di calcolare per ciascun amminoacido una Costante di Colore (la reazione con ninidrina può dare una resa in colore violetto-letto a 570 nm- leggermente diverso per i singoli amminoacidi. La costante di colore si usa poi per trovare la quantità del determinato amminoacido. C = A nmoli (aa della calibrazione) nmoli (aa n ) = A C

41 OBIETTIVI DEL CORSO Il corso di Biochimica e Biotecnologie degli Alimenti fornirà conoscenza avanzate: i) sulla struttura e sulla funzione dei macronutrienti (carboidrati, lipidi e proteine); ii) sui relativi processi metabolici nell alimentazione e nelle biotecnologie alimentari; iii) sui principali enzimi coinvolti nella nutrizione e nelle biotecnologie (trasformazioni) del settore agroalimentare; iv) sulla qualità chimico-nutrizionale e autenticità degli alimenti e su metodologie per la loro determinazione. 41