BIOCHIMICA e BIOTECNOLOGIE degli ALIMENTI

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1 Corso di Laurea Magistrale in SCIENZE DEGLI ALIMENTI E DELLA NUTRIZIONE UMANA Insegnamento di BIOCHIMICA e BIOTECNOLOGIE degli ALIMENTI

2 Le proteine dovrebbero fornire circa il 12% delle calorie totali. Quelle di origine animale sono più complete di quelle vegetali ma si accompagnano spesso alla componente lipidica. Per le qualità nutrizionali le proteine possono essere suddivise in due distinti gruppi: PROTEINE COMPLETE dette anche nobili, che contengono tutti gli aminoacidi essenziali nelle giuste proporzioni (quasi tutte proteine animali) PROTEINE INCOMPLETE che mancano di uno o più aminoacidi essenziali oppure li contengono in quantità inadeguata ed hanno quindi una deficienza assoluta o relativa di questi ultimi (quasi tutte proteine vegetali)

3 La qualità di una proteina viene stabilita soprattutto dal valore biologico (BV), quindi in base alla presenza o meno di amminoacidi essenziali. Più precisamente si dicono: proteine ad alto valore biologico o complete proteine a medio valore biologico o parzialmente complete proteine a basso valore biologico o incomplete

4 VALORE BIOLOGICO (BV) Indica la qualità d'azoto introdotto con una determinata proteina e che è stato trattenuto per il mantenimento e per l'accrescimento. Il valore biologico esprime la completezza di una proteina cioè la presenza di tutti gli aminoacidi essenziali nelle proporzioni ottimali ai fini delle sintesi proteiche corporee. Le proteine animali (definite complete in aminoacidi essenziali) hanno un valore biologico superiore a quelle vegetali (definite incomplete in aminoacidi essenziali). Proteine complete ed incomplete vengono associate nello stesso pasto in modo da ottenere un apporto AA completo.

5 Quando la composizione proteica quali-quantitativa è nota, è possibile trarre conclusioni circa il suo valore nutrizionale che può essere indicato in vari modi fra cui: valore biologico (BV) % di azoto assorbito ed utilizzato (trattenuto) Affermare ad esempio che il riso ha un VB biologico di 64,0 vuol dire che su 100 amminoacidi assorbiti, circa 64 sono quelli utilizzati ed incorporati nelle cellule dell'organismo.

6 La qualità delle proteine alimentari dipende dalla : composizione in amminoacidi essenziali (fattore intrinseco) digeribilità della proteina (in genere 90%) biodisponibilità dei singoli AA VARI MODI PER ESPRIMERE LA QUALITA METODI BIOLOGICI basati sulla variazione di peso basati sulla ritenzione di azoto Valore biologico Ni-Ne/Ni dove Ni = azoto introdotto e Ne = azoto escreto uguale a 100 quando tutto l N viene utilizzato

7 METODI CHIMICI Punteggio (indice) chimico assegnato in base all AA limitante rispetto ad una proteina di riferimento La proteina standard è data da una combinazione tipo di AA stabilita dalla FAO (ricavata tenendo conto del fabbisogno di ogni singolo AA essenziale diviso per il fabbisogno in proteina) Questo indice è teorico, tiene conto solo del pattern amminoacidico, altri indici rivelano il reale comportamento nell'organismo

8 Indice chimico di una proteina assegnato in base all amminoacido limitante Contenuto dell amminoacido essenziale nella proteina in esame (mg/g) x 100 Contenuto dell amminoacido essenziale nella proteina di riferimento (mg/g) Si ripete questo calcolo per ogni aminoacido essenziale o per gruppi (AA solforati, ramificati, aromatici) L amminoacido per il quale si ottiene il punteggio più basso è detto LIMITANTE

9 Contenuto dell amminoacido essenziale nella proteina in esame (mg/g) x 100 Contenuto dell amminoacido essenziale nella proteina di riferimento (mg/g) Sorgente proteica Contenuto % AA essenziali Indice Chimico (AA limitante) Lys Solforati Thr Trp Ideale (FAO) 5,5 3,5 4,0 1,0 100 Cereali 2,4 3,8 3,0 1,1 44 (Lys) Legumi 7,2 2,4 4,2 1,4 68 (solforati) Latte in polvere 8,0 2,9 3,7 1,3 83 (solforati) Miscela Cereali:legumi:latte (67:22:11) 5,1 3,2 3,5 1,2 88 (Thr)

10 Metodi per la determinazione della concentrazione proteica totale e dalla amminoacidica

11 La determinazione della concentrazione proteica totale: il metodo Kjeldahl Per lunghi anni, la quantità di proteine (proteina grezza) di alimenti è stata determinata calcolando il contenuto di AZOTO totale di un alimento tal quale, senza alcuna preventiva preparazione. Il metodo Kjeldahl è il metodo di elezione per la determinazione del contenuto di AZOTO. Tale valore viene poi moltiplicato per uno specifico fattore per ottenere la quantità di proteine. Questo metodo si basa su due assunzioni: i) carboidrati e grassi alimentari non contengono azoto; ii) la quasi totalità dell azoto presente negli alimenti deriva dagli amminoacidi delle proteine.

12 Sulla base delle prime determinazioni, il contenuto medio di N nelle proteine era di circa il 16% (160 g/1000 g), che ha portato all uso del calcolo Nx6,25 (1/0,16= 6,25). Tuttavia non tutto l azoto che si può titolare è presente nelle proteine, ma anche in amminoacidi liberi, nucleotidi, creatina e colina.

13 Inoltre, il contenuto di azoto di alcuni amminoacidi (come % in peso) varia in relazione al peso molecolare dell amminoacido ed al numero di atomi di azoto in essi contenuti [da uno a quattro a seconda degli amminoacidi: tutti uno ad eccezione di Lys e Gln/Asn (2), His (3), Arg (4)]. Sulla base di queste considerazione, in realtà il contenuto di N nelle proteine varia da 5,26 (1/0,19) a 7,69 (1/0,13).

14 Gli attuali fattori sono riportati nella seguente Tabella Origine Alimento Fattore Origine Alimento Fattore Animale Uova 6,25 Vegetale Grano Chicco intero 5,83 Carne 6,25 Crusca 6,31 Latte 6,38 Endosperma 5,70 Vegetale Orzo 5,83 Ricino 5,30 Mais 6,25 Fagioli (vari tipi) 6,25 Miglio 5,83 Soia 7,71 Avena 5,83 Noccioline 5,46 Riso 5,95 Segale 5,83 Sorgo 6,25

15 Il metodo Kieldhal, fu introdotto nel 1883 e da allora è stato ampiamente studiato, modificato e migliorato. Viene ancora oggi utilizzato in tutto il mondo per determinare il contenuto in proteine totali negli alimenti. Può essere suddiviso in tre fasi: 1)Digestione o mineralizzazione 2)Distillazione 3)Titolazione

16 Digestione o mineralizzazione: Obbiettivo: rottura delle proteine e liberazione dell azoto organico, che viene convertito in ammonio Procedimento: Il campione viene mineralizzato in presenza di acido solforico concentrato alla temperatura di C, con l aggiunta di un catalizzatore a base di solfato di rame pentaidrato e H 2 O 2, allo scopo di velocizzare i tempi di reazione ed evitare la formazione della schiuma. La mineralizzazione si ritiene completata quando tutta la miscela si chiarifica, indicando che tutto l azoto organico è stato liberato.

17 Distillazione Obbiettivo: separare l azoto inorganico (ammonio) dal digerito. Procedimento: Inizialmente si esegue la neutralizzazione dell Acido solforico in eccesso, aggiungendo NaOH concentrata (previa diluizione del campione con H 2 O), al fine di rendere l azoto inorganico maggiormente volatile. A questo punto la miscela viene portata ad ebollizione, per liberare i gas di NH 3, che a loro volta sono condensati tramite l uso di un distillatore in corrente di vapore e intrappolati in una beuta contenente Acido solforico 0,1M.

18 Titolazione Obbiettivo: determinare la quantità di ammonio presente nel distillato. Procedimento Alla soluzione ottenuta dopo la distillazione, viene aggiunto un indicatore e titolata con l utilizzo di NaOH 0,1M, fino al viraggio.

19 Espressione dei risultati La %N presente nel campione sarà data da: %N = [V(H 2 SO 4 )*M(H 2 SO 4 )]-[V(NaOH)*M(NaOH)]*14*100 Pc*1000 dove: [V(H 2 SO 4 )*M(H 2 SO 4 )] = moli (H 2 SO 4 ) [V(NaOH)*M(NaOH)]= moli (NaOH) [ moli H 2 SO 4 )]-[ moli NaOH]= moli N 14 = PM azoto Pc = peso del campione %P= %N*FC FC= fattore di conversione dell alimento Il fattore 6,25 viene anche usato nelle etichette nutrizionali e per i prodotti cerealicoli in miscela.

20 SVANTAGGI: Non tutto l azoto viene dalle proteine: Purine Pirimidine DNA, RNA, ecc. Urea Altre sostanze aggiunte intenzionalmente (FRODI) In particolare, un certo numero di composti azotati idrosolubili come la melammina, il solfato di ammonio e l'urea, se aggiunti a matrici alimentari, durante l analisi delle proteine totali, non possono essere identificate con il metodo Kjeldahl, anzi aumentano il contenuto d azoto e quindi alterano il valore finale del contenuto proteico

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22 La melamina è un potente adulterante a causa del suo alto contenuto di azoto (66% in massa). Il suo utilizzo è particolarmente dannoso in quanto è in grado formare un complesso stabile con l acido cianurico che cristallizzando arreca gravi danni renali

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24 Metodi spettrofotometrici per la determinazione delle proteine

25 Per la determinazione della concentrazione di proteine parzialmente purificate sono disponibili molti metodi colorimetrici, che sfruttano la capacità delle proteine di interagire con particolari reagenti dando luogo a un prodotto colorato. L intensità del colore sviluppato si correla con la quantità di proteina presente. Parecchi di essi non forniscono un concentrazione assoluta ma relativa rispetto ad uno stock di proteina standard che viene usata per la preparazione di una retta di taratura (per il basso costo, la facile reperibilità, etc., si utilizza come standard l albumina da siero bovino, o BSA).

26 Metodo del biureto Il reattivo del Biureto consiste in una soluzione alcalina di solfato di rame contenente tartrato di sodio e potassio in ambiente basico. È un reattivo utilizzato nella determinazione quali e quantitativa delle proteine. Sfrutta le proprietà cromoforiche del complesso che si forma in ambiente basico fra Cu 2+ e legami peptidici Biureto Si forma riscaldando l'urea a C. Reagisce con la soluzione fortemente alcalina di tartrato contenente solfato di rame(ii) diluito. Da ciò deriva il nome dato al metodo.

27 Gli ioni rameici formano un complesso di coordinazione con quattro gruppi NH appartenenti ad altrettanti legami peptidici. Il complesso formato dal rame, avrà colore viola-bruno (lettura a 540 nm) Il metodo è generale (anche se i residui di prolina non reagisco) ed è molto riproducibile. Purtroppo, la sensibilità è bassa: non consente in genere di misurare concentrazioni proteiche <1 mg/ml.

28 METODO DI LOWRY (CON IL REATTIVO DI FOLIN-CIOCALTEAU) Molto usato, soprattutto nel passato. La miscela da saggiare viene dapprima portata in ambiente alcalino (ph ) e fatta reagire con citrato o tartrato di rame(ii). Dopo un certo tempo (necessario probabilmente per consentire la complessazione del rame da parte delle proteine) si aggiunge la miscela di Folin-Ciocalteau (sviluppato inizialmente per la determinazione della tirosina e quindi poi per fenoli e polifenoli), il cui componente attivo è rappresentato da una miscela di sodio molibdato, fosfato e tungstato. Con l andare del tempo si sviluppa un colore scuro, che tende al blu in presenza di proteina (in assenza, il colore tende al marrone). L intensità della colorazione blu (lettura a 660 nm), sarà proporzionale alla concentrazione di proteina.

29 Non è chiaro perché il colore blu si sviluppi, è possibile che gli acidi fosfomolibdotungstici formino dei complessi misti con rame e proteina. Poiché la presenza e quantità dei residui aromatici (in particolare, tirosinici) influenzano fortemente per lo sviluppo del colore, sembra più probabile che il meccanismo coinvolga una riduzione dello ione Cu 2+ a Cu + da parte di questi residui, seguita da una reazione dello ione rameoso con gli acidi fosfomolibdotungstici. Svantaggi: richiede tempi di incubazione precisi; inoltre alcuni tamponi ed altre sostanze possono interferire; infine, poiché il contenuto in tirosine può influenzare la colorazione, le risposte al saggio possono variare abbastanza a seconda del tipo di proteine presenti.

30 Metodo dell acido bicinconinico BCA- un saggio molto simile a quello di Lowry, con la differenza che il rame(ii) anziché in associazione con il reagente di Folin-Ciocalteau si usa in associazione con l acido bicinconinico. Si ritiene che la riduzione dello ione Cu 2+ a Cu + sia qui seguita dall associazione dello ione rameoso con l acido, con formazione di un complesso che assorbe fortemente a 562 nm (colore viola-blu). Il saggio presenta la stessa variabilità da proteina a proteina già vista per il Lowry, ma è più riproducibile e un po più sensibile. N N O- O O- O

31 Metodo di Bradford Si basa sull interazione non-covalente di un colorante (il Coomassie Brilliant Blue R-250) con le proteine. Il saggio viene effettuato a ph acido. Il colorante si lega primariamente ai residui basici ed aromatici, e la formazione di questi complessi determina uno spostamento del massimo di assorbimento del colorante da 465 a 595 nm, che può essere misurato spettrofotometricamente. Anche se diverse proteine possono dare risposte alquanto diverse in questo saggio, la sua semplicità ed elevata sensibilità (<0.1 mg/ml) fa sì che sia largamente usato. Il Coomassie Blue si usa anche per evidenziare le bande proteiche nella gel elettroforesi. Coomassie Brilliant Blue R-250

32 Determinazione della concentrazione proteica mediante l uso dell assorbimento UV Le macromolecole presentano caratteristici spettri di assorbimento dovuti all interazione delle onde elettromagnetiche e ai legami chimici presenti, tipici per ogni classe di macromolecole (ie. proteine ed acidi nucleici).

33 Determinazione della concentrazione proteica mediante l uso dell assorbimento UV La legge di Lambert e Beer Sviluppata sulla base delle ricerche di Johann Heinrich Lambert e perfezionata in seguito da August Beer, è sicuramente una delle relazioni empiriche più utilizzate per la determinazione della concentrazione di molecole e macromolecole. La legge correla la quantità di luce assorbita da una sostanza con la sua concentrazione, con la sua natura chimica e con lo spessore del mezzo attraversato A = εlc

34 Determinazione della concentrazione proteica mediante l uso dell assorbimento UV La presenza degli anelli aromatici di tirosina, fenilalanina e triptofano fa sì che le proteine presentino un assorbimento di luce nel vicino ultravioletto, con massimo a circa 280 nm. Il coefficiente di estinzione molare varia ovviamente da proteina a proteina (dipende dal numero e dalla posizione degli amminoacidi aromatici), ma in genere può essere calcolato con buona approssimazione partendo dalla sequenza amminoacidica. Va tenuto presente che molte altre sostanze possono assorbire nel vicino ultravioletto, e quindi condizionare i risultati della misura; fra queste gli acidi nucleici, che però hanno un massimo di assorbimento a 260 nm. A volte, nelle prime fasi di purificazione di una proteina, può essere utile verificare il rapporto tra gli assorbimenti a 280 e 260 nm, per verificare se e quanto una data frazione di proteina sia contaminata da acidi nucleici.

35 L assorbimento ultravioletto a 280 nm: Può rappresentare un ottima tecnica quando non si ha alcuna idea della concentrazione di un campione che deve essere assolutamente recuperato. Si usa in genere prima di passare a metodi più precisi e sensibili; La determinazione si basa sull assorbimento specifico degli aminoacidi aromatici tirosina e triptofano; La misura è soggetta a interferenza da altri componenti cellulari e in particolare acidi nucleici; Il metodo non è molto sensibile e presuppone l uso di cuvette di quarzo; Il vantaggio reale è che il campione non viene distrutto e la misura è molto rapida. [Proteina] (mg/ml) = 1.55*A *A 260 1,55 e 0,76 si riferiscono a una specifica proteina utilizzata da Christian e Warburg.

36 Determinazione della composizione amminoacidica Delle proteine alimentari

37 Stein e Moore svilupparono un metodo cromatografico per l analisi degli amminoacidi. Nel 1958 venne messo a punto il primo analizzatore automatico, che venne utilizzato nel 1959 per determinare la struttura chimica dell enzima ribonucleasi, che li porto a vincere il nobel nel 1972

38 Le fasi per determinare la composizione amminoacidica sono 1- Idrolisi delle proteine 2- Separazione e identificazione degli amminoacidi 3- Quantizzazione degli amminoacidi

39 Idrolisi Nelle proteine, gli amminoacidi sono uniti tra loro mediante il legame peptidico. Pertanto, per poterli separare e identificare, bisogna rompere il legame peptidico. Questo si può fare mediante una idrolisi CHIMICA oppure ENZIMATICA. L idrolisi Chimica si effettua, in genere, in presenza di HCl 6M, a 110 C per un tempo di ore In queste condizioni l idrolisi è completa. Tuttavia, alcuni amminoacidi possono subire delle modifiche o parziale idrolisi: - Thr, Ser e Tyr subiscono delle perdite parziali (ed il loro contenuto si estrapola al T 0 ) - Trp viene distrutto - Cys e Met possono in parte ossidarsi - Val e Ile richiedono una idrolisi a 72 ore, quando nella sequenza sono tra loro legati; - Le ammidi asparagina e glutammina vengono trasformate nei relativi amminoacidi.

40 Thr: Il suo contenuto viene corretto del 5% (in più) rispetto al contenuto calcolato a 24 h; Val ed Ile vengono calcolate a 72 ore; Trp: viene ottenuto dopo idrolisi basica con NaOH oppure con idrolisi acida con acido mercaptoetansolfonico; Met: subisce meno perdite se nella soluzione di idrolisi si aggiunge un agente protettore (tiodiglicole, fenolo); Lys, Leu, His, Arg e Phe: sono amminoacidi stabili e non richiedono particolari attenzioni.

41 Idrolisi enzimatica L idrolisi enzimatica permette di evitare la distruzione degli amminoacidi, precedentemente riportati, ma rischia di essere incompleta Tuttavia, essendo basata su enzimi dello stesso tipo di quelli utilizzati in vivo, questa tecnica libera solo gli amminoacidi effettivamente idrolizzabili durante la digestione. Per questo si ritiene che essa sia in grado di fornire la frazione di amminoacidi DISPONIBILI o UTILIZZABILI.

42 Separazione e identificazione degli amminoacidi Dopo aver idrolizzato le proteine in modo opportuno, si passa alla separazione ed alla identificazione degli amminoacidi. Gli amminoacidi si possono separare con: 1-Metodi di derivatizzazione pre-colonna seguiti dalla separazione; 2-Metodi di derivatizzazione post-colonna, in cui si ha prima la separazione e poi la colorazione degli amminoacidi. Nel primo caso si utilizzato reagenti quali fenilisotiocianato, o-ftalaldeide, reattivo di Sanger (2,4 dinitrofluorobenzene), etc. I derivati degli amminoacidi ottenuti vengono separati mediante RP- HPLC, identificati utilizzando condizioni standard e separazioni di riferimento e quantizzati.

43 La derivatizzazione post-colonna usa tecniche basate sulle proprietà di carica: Cromatografia a Scambio Ionico Questa è la procedura che meglio si adatta alla separazione di amminoacidi proteici. Il principio su cui si basa è l instaurarsi di legami elettrostatici tra le molecole da separare e gruppi carichi presenti sul supporto cromatografico. Il supporto generalmente utilizzato per la separazione di amminoacidi è un polimero di stirene/divinilbenzene che, per essere utilizzato come scambiatore di ioni, viene modificato con l introduzione di gruppi solfonici, carichi negativamente (polivinilbenzene solfonato). SCAMBIATORI IONICI FORTI : Hanno gruppi ionizzabili che ritengono la loro carica ionica in quasi tutto l intervallo di ph (1-13). SCAMBIATORI IONICI DEBOLI: Hanno gruppi ionizzabili solo in uno stretto intervallo di ph.

44 Polistirene/divinilbenzene CROMATOGRAFIA A SCAMBIO CATIONICO CH-CH 2 -CH-CH 2 -CH-CH 2 -CH-CH 2 SO 3 SO 3 SO 3 SO 3 POLIVINILBENZENE SOLFONATO

45 Fase 1: Fasi della cromatografia a scambio anionico Legame alla resina: una miscela di amminoacidi, disciolta in un tampone acido a ph 2,2, viene caricata su di una colonna cromatografica contenente la resina. In tali condizioni tutti gli amminoacidi possiedono una carica netta positiva e si legano con legame ionico alla resina Fase 2: Eluizione degli Amminoacidi: Il distacco selettivo degli amminoacidi viene effettuato facendo passare attraverso la colonna cromatografica una soluzione tampone a ph e forza ionica crescenti. Può anche essere aumentata la temperatura della colonna

46 Fase 2: L incremento di forza ionica, ottenuto aumentando la concentrazione salina dell eluente, tenderà ad indebolire i ponti salini stabilitisi tra amminoacidi e resina; L aumento di ph porterà ad una graduale deprotonazione dei gruppi acido-basici presenti sulla catena laterale. Alcuni amminoacidi tenderanno ad assumere così carica netta zero interrompendo il legame ionico con la resina e passando nell eluente per poi emergere dalla colonna cromatografica. Quanto più basso è il punto isoelettrico di un amminoacido, tanto più facilmente l aumento di ph e forza ionica porterà alla sue eluizione. L aumento della temperatura della colonna ha un effetto simile.

47 Fase 2: Fasi della cromatografia a scambio anionico Eluizione degli Amminoacidi

48 Fase 3: Colorazione: L amminoacido eluito, raggiuge il coil di reazione dove reagisch con la ninidrina alla temperatura di 135 C, dando origine ad un colore blu con gli α-amminoacidi o giallo con gli imminoacidi (prolina). L assorbimento viene dunque letto ad una lunghezza d onda di 570 (giallo) e 440 (violetto) nm. Composto di Ruhemann

49 Diagramma di flusso di un analizzatore di amminoacidi

50 Fase 4: Determinazione quantitativa: Poiché l assorbanza è proporzionale alla quantità di amminoacidi, la derivatizzazione con ninidrina consente di effettuare una determinazione quantitativa estremamente accurata degli amminoacidi rilevati come una serie di picchi (cromatogramma) che possono essere integrati per il calcolo della concentrazione. Il tempo di ritenzione del picco identifica l'amminoacido dal punto di vista qualitativo, mentre l'area dello stesso è utilizzata per ricavarne la concentrazione. Il sistema deve essere calibrato con una miscela di amminoacidi standard, da cui ricavare successivamentei dati relativi al nostro campione.

51 La calibrazione permette di calcolare per ciascun amminoacido una Costante di Colore (la reazione con ninidrina può dare una resa in colore violetto-letto a 570 nm- leggermente diverso per i singoli amminoacidi. La costante di colore si usa poi per trovare la quantità del determinato amminoacido. C = A nmoli (aa della calibrazione) nmoli (aa n ) = A C

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54 Uso nel campo alimentare: i)per valutare il valore nutrizionale di un prodotto ii) Per monitorare i livelli di aminoacidi essenziali aggiunto come additivo nei mangimi. iii) Per tracciare l'origine e l'autenticità di un prodotto Inoltre viene usato anche per: Diagnosi di errori congeniti nel metabolismo, come la fenilchetourea, monitorando il livello della fenilalanina nel sangue