Le soluzioni: Le soluzioni sono miscele omogenee di due o più componenti.

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1 Le soluzioni: Affinchè le molecole di specie diverse possano reagire fra di loro è necessario che si incontrino ed urtino le une con le altre. E chiaro che questa possibilità di urto è favorita quando le molecole hanno la libertà di muoversi nel mezzo in cui si trovano. La quasi totalità delle reazioni chimiche che vengono eseguite in biochimica clinica avvengono in soluzione liquida. Le soluzioni sono miscele omogenee di due o più componenti.

2 Nelle soluzioni liquide riconosciamo: soluto: componente presente in minore quantità solvente: componente che è presente in maggiore quantità Il solvente più comune è l acqua (in questo caso la soluzione è detta acquosa), ma esiste tutta una gamma di solventi organici ed inorganici.

3 Il soluto può essere: solido - es: NaCl (soluto) in acqua (solvente); zucchero in acqua; colesterolo in cloroformio (solvente organico) liquido - es: H 2 SO4 in acqua; alcool etilico in acqua gassoso- es: ossigeno in acqua

4 Principale fattore influenzante le soluzioni: temperatura. Per lo più la dissoluzione del soluto nel solvente è facilitata da un aumento di temperatura. Ad una data temperatura si scioglie in un certo volume di solvente una certa quantità in peso di soluto = solubilità Oltre tale quantità non se ne scioglie altra e si ha una precipitazione del soluto, in quanto il solvente si dice saturo di esso. Tali soluzioni nelle quali è presente una certa quantità, anche minima, di soluto indisciolto, cioè di corpo di fondo, prendono il nome di soluzioni sature

5 Concentrazione di una soluzione: Per indicare le caratteristiche di una soluzione è necessario indicare, oltre al tipo di soluto e di solvente, anche i rapporti ponderali tra di essi. Parliamo perciò di concentrazione di soluto nel solvente. Ci sono diversi modi per esprimerla: concentrazione in % di soluto: si riferisce al peso o al volume dei costituenti della soluzione. Es: soluzione al 20% di NaCl (20g di NaCl in 80g di H 2 O)

6 molarità: moli di soluto/ litri di soluzione (soluzioni molari). normalità. La soluzione normale contiene un grammo equivalente di sostanza per litro di soluzione, cioè quantità in grammi pari al peso equivalente. Il peso equivalente è la quantità di sostanza che reagisce durante un processo chimico.

7 Ricapitolando: Molarità : n. moli di soluto n. litri di solvente Normalità: n. gr. equival. di soluto n. litri di soluzione

8 La concentrazione di una soluzione può variare entro limiti molto ampi a seconda della natura del soluto del solvente e della solubilità del soluto nel solvente. Tuttavia non può andare oltre una soglia che rappresenta il massimo di solubilità di un soluto, oltre la quale la soluzione diventa satura. Non ci sono limiti, invece, per quello che riguarda la diluizione di una soluzione (ovvero passare da una concentrazione della soluzione ad una concentrazione inferiore).

9 Come si effettua una diluizione?

10 Diluizioni: Teniamo presente che il prodotto per il volume della soluzione per la sua concentrazione è una costante; per cui se si ha ad esempio una soluzione di concentrazione molare M 1 e volume V 1, per ottenere una soluzione diluita di concentrazione M 2, è necessario portare la soluzione ad un volume V 2 in modo che sia rispettata la relazione : V1 x M1 = V2 x M2

11 Es: prepariamo 50ml di una soluzione 0,4 mol/ l partendo da una soluzione 2 mol/ l dobbiamo fare il seguente calcolo: 50 x 0,4 = X x 2 X = 50 x 0,4 2 = 10 ml Quindi dobbiamo prendere 10 ml della soluzione di partenza, porli in un cilindro da 50ml e portare a volume. Abbiamo cioè diluito di 5 volte

12 Proprietà delle soluzioni: innalzamento del punto di ebollizione: a pressione atmosferica l acqua bolle a 100 o C; mantenendo costante la pressione una soluzione acquosa bolle a temperatura maggiore. abbassamento del punto di congelamento: analogamente a prima, mentre l acqua congela a 0 o C, una soluzione acquosa congela a temperature inferiori. densità: peso specifico o densità relativa di un corpo solido o liquido e quindi anche di una soluzione è il rapporto tra il peso in grammi del corpo e quello di un ugual volume di acqua distillata alla temperatura di 4 m d = v

13 Misura dell acidità: La minore o maggiore acidità di una soluzione dipende dalla maggiore o minore concentrazione degli ioni H +. Per ph di una soluzione si intende l inverso del logaritmo decimale della concentrazione idrogenionica di tale soluzione, espressa in moli / litro ph = - log [H + ] Il ph di una soluzione può essere variato perciò con l aggiunta di un acido o di una base. Tutta la scala di ph, a partire dall acidità massima fino alla massima basicità, è compresa tra 0 e 14. Esattamente al centro di questa scala troviamo il ph 7, caratteristico della neutralità, che è il ph dell acqua pura

14 Misure di ph ed indicatori: Misurare il ph di una soluzione vuol dire misurare la concentrazione di ioni H + presenti nella soluzione stessa. Tale misura puo essere eseguita: in maniera molto accurata mediante l uso di potenziometri in maniera più grossolana sfruttando le proprietà di alcuni coloranti chiamati indicatori. Queste sostanze hanno la proprietà di assumere colore diverso a seconda del ph della soluzione in cui sono disciolte. Caratteristico di ogni indicatore è il suo punto di viraggio, ossia il ph nell intorno del quale avviene il cambiamento di colore

15 Es. blu timolo rosso a ph< 1 e giallo a ph> 3. Tra il ph 1 e 3 si ha una zona intermadia detta di viraggio. Esistono in commercio cartine all indicatore universale o phmetri elettronici.

16 Alcuni tipi di reazioni chimiche: reazioni di neutralizzazione: in esse si ha neutralizzazione totale o parziale di un acido da parte di alcali o viceversa soluzioni tampone: mantengono invariato il ph di una soluzione durante una reazione, in contrasto magari con l ambiente o con lo svolgersi della reazione che tenderebbe ad alzarlo o abbassarlo. I tamponi sono costituiti da un acido debole e un suo sale o da una base debole ed il sale corrispondente

17 reazioni di titolazione acido-base: per titolazione si intende il processo mediante il quale si riesce a dare titolo ad una soluzione, cioè si riesce a stabilire la sua concentrazione in una data specie. La titolazione di una soluzione acida consiste nell aggiungere progressivamente piccole aliquote di una soluzione alcalina fino a completa neutralizzazione dell acido

18 Il problema consiste nell individuare esattamente il momento in cui tutti gli ioni H + sono stati neutralizzati dagli ioni OH - aggiunti. Questo punto si dice punto di equivalenza (punto in cui si sono mescolate quantità equivalenti di acido e di base) Esso può essere determinato seguendo le variazioni di ph con un opportuno indicatore.

19 Cinetica chimica: Studia le reazioni dal punto di vista della loro velocità e del meccanismo. Per velocità di reazione si intende la velocità con la quale avviene una certa trasformazione chimica, e il meccanismo di reazione indica tutti i vari stadi attraverso i quali passano i reagenti. La velocità di una reazione dipende da: 1. Natura dei reagenti 2. Concentrazione dei reagenti 3. Temperatura 4. Catalisi

20 1. Natura dei reagenti: Durante una reazione chimica certi legami si spezzano per darne luogo ad altri, processo che può essere più o meno rapido. Vi sono reazioni velocissime (come quelle di neutralizzazione acido-base e altre estremamente lente). 2. Concentrazione degli stessi: solamente sperimentalmente si può verificare quale è l influenza della concentrazione dei singoli reagenti sulla velocità di reazione. Sperimentale si è potuto ricavare una espressione cinetica di carattere generale: la velocità di una certa reazione è proporzionale, secondo una costante K, al prodotto delle concentrazioni dei reagenti, espresse in moli per litro. VELOCITA = K [A] [B] [C]

21 3. Temperatura: Anche per la temperatura si deve ricorrere a verifiche sperimentali per vederne l influenza sulla velocità di reazione. Una regola molto approssimativa indica che la velocità di un dato processo aumenta di 2-3 volte per un aumento di temperatura di Catalisi: Alcune reazioni che di per sé risulterebbero molto lente o che praticamente apparirebbero ferme, possono venire accelerate notevolmente se fatte avvenire in presenza di particolari sostanze dette catalizzatori. Questi si ritrovano inalterati alla fine del processo. Vi sono molte sostanze che funzionano da catalizzatori per es. platino, ione Mn 2+, enzimi.

22 Le funzioni delle proteine.. Catalisi Immunoglobuline Trasporto Regolazione Strutturale Movimento Enzimi Anticorpi del sistema immunitario Movimento di materiali, ossigeno, Ormoni, metabolismo Copertura e supporto: pelle, tendini, unghie, ossa Muscoli, cilia, flagelli

23 FUNZIONI Funzione plastica e costruttrice : ci permettono di crescere e di mantenere le strutture del nostro corpo. Funzione regolatrice : controllano molti processi dell'organismo, sotto forma di enzimi e di ormoni. Funzione energetica : nella dieta.

24 Funzione di trasporto ematico : alcune di esse trasportano i nutrienti e altre sostanze nel sangue; per esempio le lipoproteine trasportano i grassi e l'emoglobina l'ossigeno. Funzione di difesa immunitaria : gli anticorpi sono delle proteine preposte alla difesa del nostro organismo. Funzione di difesa dagli agenti esterni : la cheratina è la proteina che costituisce unghie, peli e capelli, che proteggono le zone più delicate dagli urti o dal freddo.

25 Purificazione di una proteina E possibile purificare una proteina che può essere presente anche in minima parte (~0.001%) da una miscela grezza contenente molte altre proteine, acidi nucleici, polisaccaridi, lipidi e molecole più piccole (zuccheri, peptidi, aminoacidi, ormoni, etc.). A seconda degli scopi la purificazione può essere di tipo analitico o preparativo.

26 Per una corretta purificazione della proteina in esame bisogna: 1. Scegliere un saggio specifico per seguire l attività biologica della proteina 2. Considerare le proprietà della proteina 3. Scegliere, se possibile, una fonte molto ricca del prodotto desiderato 4. Cercare di usare il minor numero possibile di passaggi di purificazione

27 1. SAGGIO SPECIFICO Un saggio specifico deve basarsi su proprietà uniche della proteina: un'attività enzimatica un' attività immunologica caratteristiche fisiche (es. massa molecolare, proprietà spettroscopiche,etc.) un'attività biologica

28 Idealmente un saggio dovrebbe essere: specifico (non si vuole un falso positivo) rapido (non vogliamo aspettare giorni per un risultato) sensibile (non vogliamo consumare tutto il nostro campione solo per saggiarlo) quantitativo (ci serve un metodo accurato per misurare la quantità di purificazione) proteina ad ogni passaggio della

29 2. Le proprietà delle proteine che vengono sfruttate per ottenere lo scopo sono: la dimensione e forma il contenuto in aminoacidi acido o basici (la carica di una proteina è la somma delle cariche (+) e (-) ad un dato ph sulla superficie. il punto isoelettrico la distribuzione di carica (ci può essere una distribuzione non uniforme sulla superficie) solubilità (influenzata da ph, forza ionica) densità (~1.4 g/cm3) lipoproteine<proteine<fosfoproteine idrofobicità (numero e distribuzione dei residui idrofobici) capacità a legare metalli o altre molecole capacità di associazione e dissociazione (reversibili) specificità di sequenza o di struttura (anticorpi) presenza di modifiche post-traduzionali altre proprietà (es. termolabilità)

30 Assorbimento Determinazione della concentrazione proteica mediante spettrofotometria Spettro di assorbimento UV-VIS di una proteina Picco di assorbimento di Tirosine, Triptofani e Fenilalanine Lunghezza d onda λ (nm) UV = 200 nm 350 nm

31 La concentrazione delle proteine può essere stimata misurando l assorbanza delle soluzioni contenenti le proteine a 280 nm (UV) Il metodo è adoperato comunemente perché non distrugge il campione ed è molto rapido La maggior parte delle proteine ha un massimo di assorbimento a 280 nm per la presenza degli amminoacidi aromatici triptofano (W), tirosina (Y) e fenilalanina (F) Poiché la composizione in amminoacidi delle proteine varia notevolmente, l assorbimento molare varierà anch esso di molto, a seconda del contenuto di questi amminoacidi Proteine che non contengono W, Y e F non avranno un massimo di assorbimento a 280 nm, mentre proteine che contengono molti residui di W, Y e F avranno elevati valori di assorbimento molare, con un massimo di assorbimento a 280 nm. Il metodo non è quindi molto accurato a meno che la proteina sia pura e ne sia noto l assorbimento molare.

32 Svantaggi Necessità di utilizzare cuvette di quarzo A meno che la proteina non sia libera da altri composti che assorbono luce a 280 nm, i risultati saranno poco accurati Gli acidi nucleici sono particolarmente fastidiosi perché gli anelli purinici e pirimidinici hanno massimi di assorbimento vicini a 260 nm, con un assorbimento considerevole che si estende fino a 280 nm Se gli acidi nucleici sono gli unici contaminanti, la concentrazione della proteina può essere stimata adoperando una formula che corregge ragionevolmente bene per il contenuto in acidi nucleici: [proteina] (mg/ml) = 1,55 A 280 0,76 A 260

33 Metodi colorimetrici: Metodo di Lowry BCA Bradford Tutti questi metodi si basano su alcuni principi comuni: la soluzione proteica reagisce con un reagente dando luogo ad un prodotto colorato la quantita del prodotto viene quindi determinata allo spettrofotometro con appropriata calibratura si correla l intensita della colorazione alla quantita della proteina

34 Metodo del Biureto Il reattivo del biureto è costituito da una soluzione di solfato di rame alcalino contenente potassio tartrato di sodio In condizioni alcaline gli ioni rameici Cu 2+ formano un complesso di coordinazione con quattro gruppi NH presenti in altrettanti legami peptidici Il complesso che si forma assorbe luce nel visibile, con un picco a 550 nm R N N Cu CU+2 2+ O O N N R

35 Vantaggi Essendo basato sull interazione degli ioni rameici con i legami peptidici, il metodo è molto riproducibile Svantaggi Scarsa sensibilità: il metodo non si dimostra infatti adatto alla determinazione di concentrazioni inferiori ad 1 mg/ml Interferenza da parte dei sali ammonici: inutilizzabile su campioni proteici ottenuti per precipitazione con ammonio solfato perché questi campioni contengono alte concentrazioni di ammonio

36 Metodo di Lowry: quantitativi proteici inferiori a 10µg/mL Schema di reazione Lowry modificato = prodotto +stabile Proteine+Cu + OH - complesso tetracoordinato-cu +1 + Folin fenolo+ Acido Fosfomolibdenico / fosfotugstenico complesso colorato Blu A 750nm Le proteine si fanno reagire con una soluzione alcalina contenente solfato di rame in presenza di tartrato (reagente di Folin: tugstato, molibdato e fosfato di sodio), si sviluppa un colore blu porpora che assorbe ad un massimo di A 660nm.

37 Vantaggi Poco costoso Di facile esecuzione Altamente riproducibile Molto sensibile: è possibile determinare concentrazioni fino a 10 µg/ml Svantaggi E soggetto ad interferenze da parte di una varietà di sostanze, quali Tris, HEPES ed EDTA Le curve standard sono lineari solo a basse concentrazioni proteiche Sono necessari tempi di incubazione precisi per ottenere dati riproducibili La reazione dipende dal ph ed è necessario avere un ph compreso tra

38 Metodo BCA La reazione del BCA (acido bicinconinico) è simile a quella del reattivo di Lowry Cu +2 è ridotto a Cu +1 dalle molecole proteiche in soluzione alcalina Due molecole di BCA chelano uno ione rameoso (Cu +1 ) Tale evento determina la formazione di un intenso colore violetto con un massimo di assorbimento a 562 nm

39 Reazione BCA Proteina + Cu +2 OH - Cu +1 - OOC N N COO - Cu BCA +1 Cu - OOC N N COO -

40 Vantaggi Sensibilità simile a quella del metodo di Lowry (10 µg/ml) Ridotta suscettibilità alla presenza di detergenti Dopo un incubazione di 30 minuti a 37 C il colore è sufficientemente stabile per misurazioni attendibili (spostamento del 2,5% in 10 minuti) Il colore continua a svilupparsi lentamente nel tempo Interferenza da parte di carboidrati Svantaggi Altre sostanze che interferiscono con il metodo BCA: catecolamine, triptofano, lipidi, rosso fenolo, cisteina, tirosina, saccarosio, glicerolo non puro, H 2 O 2, acido urico e ferro.

41 Metodo di Bradford Questo metodo si basa sul legame del colorante Coomassie Brilliant Blue G-250 alle proteine Protein + Comassie brilliant blue (acidic, A465nm) Protein Dye complex (A595nm) E basato sull immediato shift di assorbimento da 465nm a 595 nm che occorre quando il colorante Comassie Brilliant blue G-250 si lega alle proteine (in particolare ai residui di Arg, TRP, Tyr, Phe e His) in soluzione acida. Tale colorante forma forti complessi non covalenti con le proteine tramite interazioni elettrostatiche con gruppi amminici e carbossilici e tramite forze di van der Waals.Questa interazione causa lo shift di assorbimento con un picco a 595nm.

42 Metodo di Bradford Il legame del colorante Coomassie Brilliant Blue G-250 alle proteine determina uno spostamento del massimo di assorbimento del colorante da 465 nm (rosso) a 595 nm (blu) in soluzioni acide Il colorante è preparato come soluzione stock in acido fosforico Il metodo è un semplice procedimento costituito da un unico passaggio in cui il colorante è aggiunto ai campioni e si determina l assorbanza a 595 nm

43 OCH 2 CH 3 Coomassie Brilliant Blu R HN N SO 3 Na N+ SO 3 Na La quantità di colorante che si lega è proporzionale alla quantità di proteina presente in soluzione. Pertanto l intensità del colore blu (e dunque l assorbimento) è proporzionale alla concentrazione proteica. In genere quantità uguali di proteine differenti legano la stessa quantità di colorante il saggio è indipendente dal tipo di proteina

44 Poiché l intensità della colorazione non è lineare in una vasta gamma di concentrazioni di proteine, si raccomanda fortemente di preparare una curva standard per ogni saggio. 1 mg/ml BSA 2 mg/ml BSA 4 mg/ml BSA 8 mg/ml BSA 16 mg/ml BSA Normalmente per la curva standard si usano concentrazioni crescenti di BSA (albumina sierica bovina) X mg/ml

45 Intensità del colore blu Assorbanza a 595 nm mg di proteina

46 Semplicità di preparazione del reattivo Sviluppo del colore immediato Stabilità del complesso Vantaggi Elevata sensibilità (fino a 22 µg/ml) Il saggio è compatibile con la maggior parte dei tamponi comuni, degli agenti denaturanti come guanidina HCl 6M e urea 8 M e dei preservanti come sodio azide Svantaggi Il reagente colora le cuvette ed è piuttosto difficile da rimuovere La quantità di colorante che si lega alla proteina dipende dal contenuto in aminoacidi basici ciò rende difficile la scelta di uno standard Molte proteine non sono solubili nella miscela di reazione acida