PURIFICAZIONE E CARATERIZZAZIONE DELLE PROTEINE

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1 PURIFICAZIONE E CARATERIZZAZIONE DELLE PROTEINE FATTORI DETERMINANTI - QUALITÀ, QUANTITÀ, COSTO la rispettiva rilevanza dipende dal contesto: ricerca di base, R&D o produzione Le proteine si possono ottenere o dal sito di produzione endogena (es. una cellula) o mediante tecniche ricombinanti. Devono poi essere liberate e separate da tutti gli altri componenti cellulari Questo può necessitare la LISI CELLULARE Metodi fisici - Omogeneizzazione - estrusione (pressa di French) - cavitazione (shock osmotico) Metodi chimici/biochimici - solventi (es. toluene) - detergenti (es. triton-x) - enzimi (es. lipasi, lisozima)

2 PURIFICAZIONE E CARATERIZZAZIONE DELLE PROTEINE È necessario inattivare enzimi che possono degradano le proteine (es. lavorando a freddo e aggiungento alla sospensione inibitori per gli enzimi proteolitici) Si procede quindi a separare le proteine in soluzione da detriti celluari mediante centrifugazione dialisi ultrafiltrazione Si eliminano altri tipi di macromlecole solubili (es. acidi nucleici) con enzimi specifici che li degradano (nucleasi)

3 SALTING OUT E DIALISI 2) SALTING OUT aggiunta di solfato di ammonio - un sale altamente igroscopico (NH 4 ) 2 S0 4 20% 40% proteine meno solubili centrifugazione 60% proteine molto solubili 3) DIALISI per eliminare il sale ed altre specie a piccole dimensioni Sezione del tubo di dialisi biochimica

4 GEL ELETTROFORESI una specie carica si muove in un campo elettrico con velocità pari a: v = V.q / f.d voltaggio carica coeff. frizione dist. elettrodi f r. grandezza GEL di AGAROSIO Polisaccaride estratto da alghe rosse [(1 6) -D-galattosio-(1 4)3,6-anidrogalattosio viscosità biochimica

5 10kb 3 kb 2 kb 1.5 kb 1 kb 0.5 kb DNA genomico 3 Mb separazione di frammenti di DNA plasmide 2.8 kb ssrna frammenti visualizzazione dei frammenti con etidio bromuro L EB è molto tossico sostituito con GelRed TM, SYBR TM

6 GEL ELETTROFORESI (CONT.) SDS-PAGE (PolyAcrilamide Gel Electrophoresis) separazione di proteine ed oligonucleotidi visualizzazione dei frammenti con coloranti o marker radioattivi proteina in forma nativa + SDS proteina denaturata incapsulata da Molecole di SDS - - poliacrilammide

7 2 lastre di vetro sigillare con agarosio spaziatore SDS-PAGE preparazione del gel biochimica

8 SDS-PAGE inserimento nel apparato per elettroforesi pozzetto biochimica

9 SDS-PAGE caricamento del campione Loading buffer: Proteine da separare + blu di bromofenolo (colorante) + glicerolo (10%, addensante)

10 SDS-PAGE sviluppo del gel con blu di coumassie

11 In SDS-PAGE la mobilità nel gel è proporzionale alla grandezza con l utilizzo di marker proteici a grandezza nota è possibile stimare la massa di una proteina ignota (con bassa precisione) Il gel fornisce indicazioni su quante diverse proteine sono presenti (purezza) permette di stimare la loro abbondanza relativa (intensità della banda)

12 METODI CROMATOGRAFICI La separazione di macromolecole in una miscela dipende dalla loro interazione differenziale con la matrice cromatografica (fase stazionaria) all interno della colonna. Le molecole da separare sono disciolte nella fase mobile (un solvente note come l eluente) che passa attraverso la colonna ad una velocità definita (ml/min) Le molecole che non interagiscono con la fase stazionaria escono con il fronte dell eluente. Quelle che interagiscono sono rallentate. Più forte è l interazione, più lento il tempo di transito. Le proteine si separano in base alle loro caratteristiche chimico-fisiche: Spettro_ fotometro 1) Idrofobicità/polarità della superficie 2) Carica 3) Grandezza 4) Interazioni specifiche con ligandi

13 5) METODI CROMATOGRAFICI CROMATOGRAFIA A FASE INVERSA (RP - HPLC) Fase stazionaria organica, fase mobile H 2 0 org. Peptidi/proteine legano alla fase stazionaria mediante interazioni idrofobiche. Si staccano in base all organicità della fase mobile H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O CH 3 CN H 2 O CH 3 CN CH 3 CN CH 3 CN H 2 O FA biochimica

14 CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO (IEX) Fase stazionaria (matrice polimerica quale polistirene o polisaccaride) modificata con gruppi cationici (+) o anionici (-) peptidi/proteine legano alla fase stazionaria mediante interazioni elettrostatiche. fase mobile è acquosa con concentrazione crescente di sali o ph i polipeptidi si staccano in base alla crescente forza ionica o ph della fase mobile H 2 O Na + Na + H 2 O H 2 O Na + Na + H 2 O Na + gruppi ionici comunemente utilizzati per modificare la fase stazionaria sono: - gruppi solfato (anionico forte) - gruppi carbossimetile (anionico debole) - gruppi dietilammino etile (cationico debole) - gruppi amminoetile 4 (cationico forte) H 2 O Na + resina PS-SO

15 CROMATOGRAFIA A ESCLUSIONE / GEL PERMEAZIONE (GPC) granuli di polisaccaride polimerizzato molecole piccole entrano nei pori le molecole grandi restano negli interstizi La fase stazionaria è un gel di polisaccaride su un supporto solido Le proteine si separano in base alla loro grandezza. Le proteine più piccole entrano nei pori della matrice cromatografica e sono rallentate Quelle più grandi sono escluse dai pori e passano per gli interstizi fra le particelle della fase stazionaria, eluendo più velocemente.

16 CROMATOGRAFIA AD AFFINITA (AC) Interazione specifica con un recettore (o un ligando) legato alla fase stazionaria es. proteina/ligando; anticorpo/antigene; oligonucleotide/oligo complementare metalli/polipeptide (ES. His-tag lega con Ni) + GG GG + GG proteina ricombinante con His tag HisHisHisHis Ni Ni

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18 METODI SPETTROFOTOMETRICI - DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE METODI SPETTROFOTOMETRICI (non distruttivi) - assorbimento del legame peptidico ( cm -1 M -1 ) - assorbimento della tirosina ( cm -1 M -1 ) - assorbimento della triptofano ( cm -1 M -1 ) METODI COLORIMETRICI (distruttivi) - acido bicinconinico (legami peptidici) - blue di coumassie - saggio della ninidrina (gruppi amminici) 0.4 A 0.2 proteina standard ANALISI AMMINOACIDICA (distruttivo) - metodo molto preciso - determina la concentrazione dei singoli residui M concentrazione

19 SPETTROMETRIA DI MASSA IONIZZAZIONE SEPARAZIONE RIVELAZIONE le molecole devono essere ionizzate in fase gasseosa Interazione carica campo magnetico m/z moltiplicatore ionico ELECTROSPRAY IONISATION (ES-MS)

20 SPETTROMETRO ESI QUADRUPLO camera ad alto vuoto..... filtro a quadrupolo detector

21 SPETTROMETRO MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight) proteine biochimica

22 ANALISI della composizione AMMINOACIDICA (AAA) Idrolisi acida Derivatizzazione HCl RP-HPLC C molecola derivatizzante fenil isotiocianato fluorescamina Scopi: Composizione di proteine (obsoleto) Determinazione della concentrazione di proteine Identificazione di AA inusuali (modificati) Analisi di AA liberi in fluidi (es. urina analisi cliniche)

23 SEQUENZIAMENTO DI PROTEINE (METODO DI EDMAN) Derivatizzazione dell N-terminale di una proteina immobilizzata immobilizzazione marcatura rilascio marcatura Idrolisi acida (TFA - trifluoroacteico) rilascio biochimica

24 DICROISMO CIRCOLARE (CD) Le onde elettromagnetiche della luce normalmente oscillano in tutte le direzioni Speciali filtri detti «polarizzatori» possono selezionare le componenti «polarizzate» La luce linearmente polarizzata a sua volta è composta da luce circolarmente polarizzata luce linearmente polarizzata luce circolarmente polarizzata a destra e sinistra

25 Sostanze chirali hanno coefficienti di estinzione ( ) diversi per luce circolarmente polarizzata a destra o sinistra Luce linearmente polarizzata che transita per una sostanza chirale viene quindi elitticamente polarizzata non chirale + = chirale + = Il grado di ellitticità può essere misurato e fornire uno spettro di «dicroismo circolare» nelle catene proteiche ci sono molti centri chirali posti in segmenti con strutture secondarie asimmetriche

26 q (ellitticità) Absorption (A) DICROISMO CIRCOLARE (CD) DELLE PROTEINE Il grado di ellitticità (q) corrisponde al diverso assorbimento di luce circolarmente polarizzata a sinistra (A L ) e destra (A R ) da parte dei centri chirali posti in conformazioni asimmetriche Dalla differenza di assorbimento si può determinare lo spettro CD A L A R Wavelength (l) A = c l (Beer-Lambert) DA = A L -A R DA = ( L R ) c l = D c l q ~ 3300 D Gli elementi di struttura secondaria nelle catene proteiche danno luogo a spettri di dicroismo circolare caratteristici per ogni tipo di conformazione

27 Gli spettri CD delle proteine riflettono il contributo di ciascun elemento conformazionale presente nella struttura % -elica, 20% rc 20% % 4 =

28 Il dicroismo circolare permette anche di seguire la transizione fra due diverse conformazioni es. dalla conformazione disordinata ad una conformazioner regolare durante il processo di ripiegamento Da una conformazione ad un altra cuasata da interazioni specifiche

29 Determinazione della struttura molecolare lenti ottiche Il limite di risoluzione è ½ la lunghezza d onda Microscopia elettronica ( ~ 10 nm) lenti elettromagnetiche Diffrazione di raggi X ( ~ 0.1 nm) - Richiede la diffrazione di molti atomi in molte molecole poste in modo molto regolare (cristalli)

30 CRISTALLOGRAFIA A RAGGI-X (XRS) Per ottenere cristalli di proteine, servono diversi mg di materiale puro (spesso ricombinante) Il processo di cristallizzazione dovrebbe essere molto lento (es. metodo hanging drop) E poi possibile ottenere immagini di diffrazione dei raggi-x incidenti sul cristallo e da questi ricosteruire mappe di densità elettronica (strutture molecolari) 1 Å 2 Å 3Å

31 RISONANZA MAGNETICA (NMR)

32 Risonanza Magnetica Bidimensionale (2D-NMR) < 5Å < 5Å < 5Å < 5Å