Tecniche elettroforetiche:

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1 Tecniche elettroforetiche: Gel di agarosio, Nativa, SDS-PAGE, Isoelettrofocalizzazione, 2D-PAGE

2 L elettroforesi è una tecnica che consiste nella migrazione differenziata in un campo elettrico, di molecole elettricamente cariche. Omogenato di farina di soia. SDS-PAGE gentilmente fornito dalla Dott.ssa M. Simonetti

3 L elettroforesi è una tecnica che viene usata per separare molecole elettricamente cariche. 1. relativamente poco costosa 2. rapida 3. versatile Molte molecole di interesse biologico, come gli amminoacidi, i peptidi, le proteine, i nucleotidi e gli acidi nucleici, possiedono gruppi ionizzabili e possono esistere in soluzione come specie elettricamente cariche, sia come cationi, sia come anioni. Anche composti tipicamente non ionici, come i carboidrati, possono assumere una carica se trasformati chimicamente oppure se sono strutturati in polimeri complessi quali i glicosamminoglicani.

4 Da considerazioni di carattere fisico, si risale alla seguente formula: Ve = q x E 6p x h x r La velocità elettroforetica (Ve) è direttamente proporzionale alla carica della particella (q) e al campo elettrico applicato (E=V/d) e inversamente proporzionale alla viscosità (h) e alle dimensioni della particella (r), quindi nel caso di particelle aventi la stessa carica, migrerà più velocemente la particella di raggio minore.

5 Elettroforesi verticale e orizzontale protein electrophoresis nucleic acids electrophoresis

6 La matrice può essere composta da una varietà di differenti materiali, inclusa la carta, l acetato di cellulosa, o gel fatti di poliacrilammide e agarosio.

7 Agar: L agar è una miscela, non tossica ricavato da alghe rosse, di due polimeri derivati dal galattosio: l agarosio e l agaropectina. Sottoforma di gel all 1% l agar presenta un elevato contenuto d acqua, una buona struttura fibrosa, un diametro dei pori elevato ed una bassa resistenza frizionale. Sostanza o miscela non pericolosa secondo la regolamentazione (CE) N. 1272/2008. Questa sostanza non è classificata come pericolosa secondo la Direttiva 67/548/CEE. I gel di agarosio sono usati soprattutto per la separazione di acidi nucleici e frammenti di DNA; in questo caso la migrazione differenziale è funzione semplicemente del numero di basi di cui sono composti gli acidi nucleici da separare.

8 Digestione enzimatica miniprep rfaah-dtm. Gel di agarosio gentilmente fornito dalla Dott.ssa M. Simonetti tecnica che permette di separare facilmente i frammenti di DNA. A seconda della loro lunghezza i frammenti rimarranno intrappolati nelle maglie formate dall'agarosio

9 Il SYBR Green I è un agente intercalante e si lega preferenzialmente a DNA a doppio filamento (dsdna). Il complesso DNA-colorante assorbe luce blu ad una lunghezza d'onda λmax = 488 nm ed emette luce verde λmax = 522 nm. Altri picchi di assorbimento, sebbene più deboli, si trovano nella regione dell ultravioletto (λ= 284 nm e 382 nm)

10 Application: A proprietary unsymmetrical cyanine dye which is an ultrasensitive stain for postelectrophoresis staining of dsdna in agarose or polyacrylamide gels. SYBR Green I can also be used to detect ssdna and RNA in denaturing agarose/formaldehyde and polyacrylamide/urea gels without any prewashing steps, although the sensitivity is lower (approximately 100 to 300 pg per band using 254 nm epi-illumination). SYBR Green II is recommended for ss-dna and RNA. SYBR Green I stain has been shown to be much less mutagenic than ethidium bromide in Ames tests. SYBR Green I is also a very sensitive stain for oligonucleotides, allowing for detection of as little as 1-2 ng of a synthetic 24-mer on a 5% polyacrylamide gel, which is times greater sensitivity than obtained with ethidium bromide. Staining agarose gels with SYBR Green I does not interfere with the transfer of nucleic acids to membranes or subsequent hybridization in Southern or Northern blot analysis as long as 0.1%-0.3% SDS is included in prehybridization and hybridization buffers to remove the dye. Sostanza o miscela non pericolosa secondo la regolamentazione (CE) N. 1272/2008. Questa sostanza non è classificata come pericolosa secondo la Direttiva 67/548/CEE.

11 Std non dig bp 2000 bp 1650 bp Digestione enzimatica miniprep rfaah-dtm ( ) Std non dig digerito bp 2000 bp 1650 bp Digestione enzimatica miniprep prot C269S Gel di agarosio gentilmente forniti dalla Dott.ssa M. Simonetti

12 Digestione enzimatica miniprep delle proteine 1 e 2 Std Prot1 Prot bp 2000 bp 1650 bp Gel di agarosio gentilmente forniti dalla Dott.ssa M. Simonetti

13 Elettroforesi su gel di poliacrilammide Due Tipi: Elettroforesi Nativa: le proteine si muovono in funzione della loro massa e della loro carica netta Elettroforesi Denaturante in presenza di SDS (SDS-PAGE): le proteine, uniformemente dotate di carica negativa (SDS), si muovono in base alla loro massa.

14 Poliacrilammide: L'acrilammide è l'ammide dell'acido acrilico. A temperatura ambiente si presenta come un solido cristallino incolore o leggermente bianco, solubile in acqua con reazione fortemente endotermica. La poliacrilammide è un derivato polimerico, che sotto forma di gel trova applicazione come mezzo di risoluzione e separazione delle proteine nell'elettroforesi e nella cromatografia. Classificazione della sostanza o della miscela Classificazione secondo il regolamento (CE) n. 1272/2008 Acute Tox. 4 H302 Nocivo se ingerito. Acute Tox. 4 H312 Nocivo per contatto con la pelle. Skin Irrit. 2 H315 Provoca irritazione cutanea. Eye Irrit. 2 H319 Provoca grave irritazione oculare. Skin Sens. 1 H317 Può provocare una reazione allergica cutanea. Muta. 1B H340 Può provocare alterazioni genetiche. Carc. 1B H350 Può provocare il cancro. Repr. 2 H361f Sospettato di nuocere alla fertilità STOT RE 1 H372 Provoca danni agli organi in caso di esposizione prolungata o ripetuta. Etichettatura secondo il regolamento (CE) n. 1272/2008 Il prodotto è classificato ed etichettato conformemente al regolamento CLP. Pittogrammi di pericolo: tossico estremamente tossico Simboli di rischio chimico

15 tecnica che permette di separare facilmente le proteine. Purificazione della proteina rfaah DTM. SDS-PAGE gentilmente fornito dalla Dott.ssa M. Simonetti A seconda del PM, ciascuna proteina rimarrà intrappolata nelle maglie formate dall acrilammide

16 Elettroforesi nativa Le proteine vengono separate sulla base della loro carica netta e in base alle dimensioni, La risoluzione è relativamente bassa, Discrimina tra proteine con PM uguale ma con carica differente, Permette la rapida purificazione e il recupero di proteine in condizioni native, Può essere usata per una colorazione catalitica, Permette lo studio di proteine polimeriche, Nell elettroforesi nativa, invece, i campioni non vengono denaturati né caricati negativamente prima della corsa: la velocità di migrazione pertanto sarà il risultato della massa molecolare del campione e della sua carica intrinseca

17 colorazione catalitica della LOX-1 di soia IEF nativa della LOX-1 di soia colorazione catalitica della Ceruloplasmina umana

18 SDS-PAGE (Sodium-Dodecyl-Sulphate-Polyacrilamide-Gel-Electrophoresis)

19 SDS-PAGE E uno dei metodi più largamente usati per separare le proteine e determinare il loro peso molecolare apparente. Abbinata al Western Blot e all Immunocolorazione costituisce un metodo riproducibile, rapido ed efficace per l isolamento e l identificazione delle proteine.

20 (SDS-PAGE) In condizioni denaturanti le proteine sono separate in un gel di poliacrilammide in base alla loro massa molecolare (MM) La miscela proteica è trattata con : H 3 C-(CH 2 ) 10 -CH 2 OSO 3- Na + Sodio dodecil solfato (SDS) detergente anionico che spezza tutte le interazioni non covalenti delle proteine native

21 Gli anioni dell SDS si legano alle catene principali in un rapporto di: ~ 1 molecola di SDS e 2 residui di amminoacidi I complessi SDS-proteina denaturata hanno una carica negativa Sottoposte ad un campo elettrico le proteine migrano dal catodo - all anodo + in base alla loro massa molecolare

22 Fasi di una SDS-PAGE 1 - Montaggio dell apparato; 2 - Preparazione del gel; 3 - Preparazione e caricamento dei campioni; 4 - Corsa elettroforetica; 5 - Colorazione; 6 - Studio dell immagine ottenuta.

23 Fase 1 - Montaggio dell apparato: - Lastra di vetro grande; - Lastra di vetro piccola; - Castello; - Pettini;

24 Lastre di vetro grande con spaziatori da 0,75 mm e 1 mm Lastre di vetro piccole Castello per il montaggio dei vetri

25 Pettini da 0,75 mm e 1 mm elettrodo Vaschetta per il tampone di corsa e il coperchio con gli elettrodi Alimentatore di corrente

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28 Fase 2 - Preparazione del gel : Porosità del gel % T Intervallo di frazionamento Generalmente al crescere di % T la dimensione dei pori decresce perché l acrilammide è più concentrata, mentre al disotto del 3% si perde l effetto setacciante.

29 La dimensione dei pori è funzione della quantità totale di monomeri (% T) presenti nella soluzione e del rapporto tra l agente cross-lincante e l acrilammide (% C). Più spesso la composizione del gel viene data come rapporto in peso acril:bis-acril (per es. 30:0,8).

30 I gel di poliacrilammide vengono preparati al momento dell uso facendo copolimerizzare acrilamide con metilen-bisacrilammide, un agente cross-lincante, in presenza di persolfato di ammonio (APS) allo 0,1-0,3% e un catalizzatore come il TEMED. Questa polimerizzazione radicalica viene fatta avvenire all interno dello spazio compreso tra due vetri, in modo da ottenere una matrice piatta con spessore che varia da 0,75 mm a 1,5 mm.

31 N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Il TEMED catalizza la rottura omolitica dell APS, producendo così i radicali necessari per la reazione di polimerizzazione radicalica dell acrilammide. Il TEMED va conservato al buio, a RT, e possibilmente, in ambiente anidro. Questo perché il TEMED è igroscopico ed in presenza di acqua si ossida perdendo le sue proprietà catalitiche. Il TEMED ossidato si riconosce in quanto assume colorazione giallastra. Classificazione della sostanza o della miscela Classificazione secondo il Regolamento (CE) n. 1272/2008 Liquidi infiammabili (Categoria 2), H225 Corrosione cutanea (Categoria 1B), H314 Tossicità acuta, Inalazione (Categoria 4), H332 Tossicità acuta, Orale (Categoria 4), H30 Elementi dell'etichetta Etichettatura secondo il Regolamento (CE) n. 1272/2008 Pittogramma di pericolo Simboli di rischio chimico infiammabile corrosivo Nocivo

32 Ammonio persolfato L APS è una molecola instabile, ed estremamente igroscopica. Quando è sciolto in acqua si scompone spontaneamente, pertanto si consiglia di preparare la soluzione appena prima dell uso. Generalmente, si prepara una soluzione madre al 10 % e la si conserva a -20 C. APS e TEMED aggiunti in quantità eccessive, oltre ad alterare le proprietà del gel, possono ossidare le proteine del campione. Classificazione della sostanza o della miscela Classificazione secondo il Regolamento (CE) n. 1272/2008 Solidi comburenti (Categoria 3), H272 Tossicità acuta, Orale (Categoria 4), H302 Irritazione cutanea (Categoria 2), H315 Irritazione oculare (Categoria 2), H319 Sensibilizzazione delle vie respiratorie (Categoria 1), H334 Sensibilizzazione cutanea (Categoria 1), H317 Tossicità specifica per organi bersaglio - esposizione singola (Categoria 3), Sistema respiratorio, H335 Elementi dell'etichetta Etichettatura secondo il Regolamento (CE) n. 1272/2008 Pittogramma di pericolo Simboli di rischio chimico estremamente tossico Comburente Nocivo

33 Preparazione del resolving gel e dello stacking gel -Preparazione del resolving gel o gel di risoluzione. La scelta della % di acrilamide è in base alle dimensioni della proteina in esame); - Preparazione dello stacking gel o gel di impaccamento (4-5%)

34 Resolving gel al 10% Componenti: Volume 20 ml H 2 O 7,9 30% acrilamide 6,7 Proteine 1.5 M Tris/HCl (ph 8.8) 5,0 10% SDS 0,2 Maglie di acrilamide 10% ammonio persolfato 0,2 TEMED 0,008

35 Menisco di ossigeno butanolo saturo di acqua (10:1) Oppure semplicemente acqua gel di separazione

36 Il TEMED, catalizza la decomposizione dello ione persolfato con formazione del radicale libero: SO 4 -. S 2 O e- SO SO 4 -. rappresenta la specie efficace (R. ) nella catalisi di polimerizzazione con persolfato. Il radicale libero R. trasferisce l'elettrone spaiato sulla catena nascente di acrilammide che funge da radicale libero essa stessa.

37 Preparazione dello Stacking al 5 %: Componenti: Volume 10 ml H 2 O 6,8 30% acrilamide 1,7 1.0 M Tris/HCl (ph 6.8) 1,25 10% SDS 0,1 10% ammonio persolfato 0,1 TEMED 0,01

38 Gel di impaccamento Dopo circa 1 h dalla deposizione del gel di separazione, si stratifica su di esso il gel di impaccamento (o stacking) Il gel di impaccamento ha un ph di 6,8 Pettine e un rapporto di acrilam/bis-acrilam pari al 5% stacking gel separating gel Appena deposto il gel di impaccamento. si dispone il pettine per la formazione dei pozzetti

39 3-Preparazione e caricamento dei campioni -Campione contenente l Albumina: -Sample buffer 5x (Tris/HCl 0.3 M ph 6.8, 10% SDS, 0.05% Blu di Bromofenolo, 50% Glicerolo e 500 mm DTT) - Riscaldare a 95 C per 5 minuti

40 Preparazione dei campioni SDS: Denatura le proteine e conferisce la stessa densità di carica negativa DTT (ditiotreitolo) e b-mercaptoetanolo: Rompe eventuali ponti disolfuro Glicerolo: Aumenta la densità dei campioni depositandoli nel pozzetto Blu di bromofenolo: Visualizza i campioni e va a costituire il fronte di migrazione Bollitura ( C per 2-5 minuti): Accelera la completa denaturazione

41 Caricamento dei campioni Dopo solidificazione dei gel, si rimuove il pettine, lasciando nello stacking la serie di pozzetti pronti per il caricamento dei campioni.

42 Caricamento dei campioni Inserimento dei campioni tra le due lastre di vetro mediante puntali monouso

43 4-Corsa elettroforetica - connessione all alimentatore di corrente; - impostazione dei valori di voltaggio o amperaggio desiderato; - avvio della corsa; - arresto della corsa quando si vede che il fronte e giunto alla fine del gel.

44 Corsa elettroforetica Stacking gel Resolving gel 8.8

45 Il ph del gel di caricamento è inferiore di circa 2 unità rispetto a quello del tampone di corsa. In quest ultimo il ph è 8,3 e la glicina (acido debole) è quindi presente per il 95% sotto forma di ione dipolare (zwitterione CH 2 (NH 3+ )COO - ) e solo per il 5% sotto forma di anione glicinato (CH 2 (NH 2 )COO - ). Quando viene applicata la corrente : gli ioni di glicina nel tampone di corsa si muovono allontanandosi dal catodo (elettrodo -) per cui si dirigono verso il campione e il gel di caricamento, ma con una mobilità inferiore rispetto allo ione Cl - ; In quel punto il ph è basso (6.8) per cui gli ioni glicina perdono molta della loro carica e rallentano il loro movimento. In questo modo la glicina non potrà portare efficacemente la corrente e saranno le stesse proteine a portarla, migrando verso l anodo.

46 Allo stesso tempo nel gel di caricamento e nel campione: gli ioni cloruro altamente mobili si muovono per allontanarsi dal catodo; questo crea una zona ristretta nella parte superiore del gel di caricamento in cui la conduttanza è molto bassa (cioè c è un alta resistenza); come risultato si avrà una concentrazione degli anioni proteici a ridosso degli ioni cloruro in ordine di mobilità ionica decrescente; Cl - > proteine > glicinato; le proteine penetrano nel gel di corsa sotto forma di bande sottilissime al seguito dello ione cloruro. Si concentrano in un volume molto piccolo e nel gel si osserva proprio la formazione di una strato molto sottile al limite tra gel di separazione e il gel di caricamento. Quando il fronte del colorante, blu di bromofenolo (presente nel campione) raggiunge la prossimità del fondo del gel, è il momento di interrompere la corsa.

47 5-Colorazione Poiché le proteine non sono direttamente visibili, il gel deve essere processato. La procedura più comune di rivelazione è la colorazione. In genere, dopo che le proteine sono state colorate, il gel viene fotografato o essiccato. Le proteine colorate su gel possono essere analizzate (PM, quantità) tramite densitometria (scanner, digital camera, densitometro) Blue di Coomassie Colorazione con Argento

48 Blue di Coomassie Il blue Coomassie si lega alle proteine con forze di Van der Waals e legami ionici tra i gruppi sulfonici del colorante e i gruppi amminici delle proteine Colorante-SO NH 3 -L-COOH (proteine basiche) Procedura: 1. rimozione del gel dall apparato di corsa e inserimento in una vaschetta pulita, 2. trattamento del gel con una soluzione di acido acetico e metanolo per fissaggio delle proteine al gel e rimozione dell SDS, 3. immersione del gel, da 5 min a 1 h, in una soluzione colorante di Blue Coomassie e acido acetico e metanolo, 4. rimozione del colorante non legato alle proteine tramite immersione del gel in una soluzione di acido acetico e metanolo.

49 Blue di Coomassie Albumina di siero bovino. SDS-PAGE gentilmente fornito dalla Dott.ssa M. Simonetti

50 Colorazione con l argento SOLUZIONI DA PREPARARE: FIXING SOLUTION: 40% etanolo; 10% acido acetico. WASHING SOLUTION I: 30% etanolo. WASHING SOLUTION II: 20% etanolo. SENSITIZER SOLUTION: 0,02% Na 2 S 2 O 3 (tiosolfato di sodio) SILVER STAIN: 0,2% AgNO 3 -fotosensibile- (Aggiungere 0,02% di Formaldeide prima dell uso). SOLUZIONE DI SVILUPPO: 3% Na 2 S 2 O 3 (Aggiungere 0,05% di Formaldeide prima dell uso). BLOCKING SOLUTION: 0,5% Glicina

51 METODICA: Incubare il gel nella Fixing solution per almeno 3h Lavare per 20 minuti nella Washing Solution I Lavare per 20 minuti nella Washing Solution II Lavare per 20 minuti in H 2 O mq Incubare il gel 1 nella Sensitizer solution Lavare per 20 secondi in H 2 O mq (x3) Colorare per 20 minuti con il Silver Stain Lavare per 20 secondi in H 2 O mq (x3) Incubare per 3-5 minuti nella Soluzione di Sviluppo Lavare per 20 secondi con H 2 O mq Incubare per 5 minuti nella Blocking Solution Lavare per 10 minuti in H 2 O mq (x3)

52 Colorazione con l argento

53 Problemi di sovraccaricamento del gel Il gel di poliacrilamide ha una capacità limitata e sovraccaricarlo con le proteine può dare risultati di precipitazioni ed aggregazione, produzione di striature e macchie. I risultati migliori si ottengono caricando, per ogni pozzetto, 20 ml di proteina denaturata concentrata 0,5 mg/ml (10 mg per pozzetto).

54 Essiccamento del gel Una volta colorati i gel devono essere essiccati per una buona e lunga conservazione

55 6 - Studio dell immagine ottenuta La massa molecolare relativa (Mr) di una proteina può essere determinata confrontando la sua mobilità con quella di una serie di proteine standard, delle quali si conosce la massa molecolare relativa, separate sullo stesso gel. E da tenere presente che tramite questa metodica si determina il peso molecolare apparente di una proteina, in quanto alcune proteine, per loro natura (composizione aminoacidica, modificazioni, ecc.) migrano in modo anomalo, non rispecchiando il loro effettivo peso molecolare.

56 Standard proteici: In commercio sono disponibili diversi standard proteici che coprono un'ampia gamma di pesi molecolari (PM) diversi. Ve ne sono per tutte le applicazioni: - per determinare con la massima approssimazione il peso molecolare, - per verificare l'efficienza di trasferimento su membrana. I marker possono essere non colorati oppure pre-colorati I primi permettono una determinazione più accurata del PM, mentre i secondi sono più adatti per la conferma dell'andamento dell'elettroforesi e del trasferimento su membrana. La maggior parte dei marker pre-colorati in commercio produce 6-12 bande che possono essere tutte dello stesso colore oppure di colori diversi. L uso di colori differenti facilita l'identificazione del PM di ogni proteina.

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58 6 - Studio dell immagine ottenuta A B C D E F Standard (low range) MM A- Fosforilasi B B- BSA C- Ovalbumina D- Anidrasi carbonica E- Inibitore della tripsina F- Lisozima , 2, 3, 4, 5, 6 = campioni di albumina

59 Determinazione della massa molecolare di catene polipeptidiche Mobilità relativa di ciascuna proteina 5 4,8 Standard Campione Log PM Log PM 4,6 4,4 4,2 y = 5,0635-0,19269x R= 0, Mobilità relativa Mobiltà relativa Standard in nero, campione in blu Standard e Campione

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61 Dopo la colorazione, si misura la distanza di migrazione di ciascuna proteina dalla sommità del gel risoluzione fino alla distanza di migrazione del colorante (fronte della corsa) Standard a PM noto Campioni distanza di migrazione del colorante distanza di migrazione degli standard distanza di migrazione del campione Fronte della corsa

62 log 10 PM Dopo la colorazione, si misura la distanza di migrazione di ciascuna proteina dalla sommità del gel risoluzione fino alla distanza di migrazione del colorante Rf = distanza di migrazione della proteina distanza di migrazione del colorante la distanza di migrazione del colorante è 5,8 PM Fosforilasi B BSA Ovalbumina Anidrasi carbonica Inibitore della Tripsina lisozima Mobilità Relativa 1,4 1,9 2,5 3,5 4,4 5,3 Log 10 4, , , , , , ,2 5 4,8 4,6 4,4 4,2 4 y = -0,2016x + 5,2104 R² = 0, Mobilità relativa

63 Principali impieghi di una SDS-PAGE Controllo di omogeneità (purificazione di una proteina) Caratterizzazione (determinazione del peso molecolare) Proteomica (analisi dell insieme di proteine di una cellula) Analisi con anticorpi (Western Blotting)

64 ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE: è la combinazione di IEF e SDS-PAGE

65 Le fasi dell elettroforesi bidimensionale Prima dimensione: IEF Equilibratura della Strip Seconda dimensione: SDS-PAGE Colorazione e studio dell immagine

66 Prima dimensione Isoelettofocalizzazione (IEF)

67 ISOELETTROFOCALIZZAZIONE pi: ph al quale la carica netta della proteina = 0 Se sottoposta all azione di un campo elettrico non si muove

68 ddp pi=7.4 0 pi= ph3 ph=7.4 0 ph=8.4 ph10 Una proteina dispersa in un gradiente di ph, si troverà ad avere carica netta positiva, negativa oppure nulla. Sottoposta all azione di un campo elettrico opportunamente orientato essa si muoverà, a seconda della carica che ha verso l elettrodo di segno opposto, fino a raggiungere il ph pari al suo pi. In questo punto essa assume carica netta nulla e non è più sottoposta all azione del campo elettrico. Più distante una proteina si trova dal suo pi maggiore sarà la sua carica e dunque anche la sua mobilità elettroforetica, mano a mano che essa si avvicina al ph pari al suo pi, la sua carica netta diminuisce e di conseguenza diminuisce anche la sua mobilità elettroforetica

69 anfoliti o sostanze anfiprotiche Gradienti di ph Immobilizzati Questi derivati dell acrilammide sono noti come Ciascuna molecola ha un suo pi, se sottoposte all azione di un campo elettrico migrano a seconda della propria carica netta. [soluzione acida all anodo (+) e basica al catodo (-)] Hanno la caratteristica di avere un alta capacita tamponante al loro pi. SVANTAGGI: Il gradiente non è stabile nel tempo (spostamento) e la forma del gradiente è influenzabile dalle molecole che vengono analizzate. Immobilines. I gruppi R possono essere gruppi carbossilici o amminici (pka da 0.8 a 4.6/ pka da 6.2 a 12). Soluzione acida + - Soluzione basica

70 Vantaggi dei gradienti di ph immobilizzato possibilità di reperire in commercio gel preformati, minimizza variazioni dovute alla preparazione dei gel; I gradienti di ph sono stabili nel tempo e non subiscono alterazioni dovute alla presenza del campione stesso. I gradienti sono praticamente continui e possono essere costruiti secondo diverse esigenze: lineari/non lineari; ampi (ad esempio ph 3-10)/molto ristretti (anche ph 4-5) Questi gel vengono solitamente venduti deidratati, e possono essere conservati a -20 C per periodi molto lunghi (anche 1 anno).

71 Gradienti di ph immobilizzati: reidratazione I gel recanti i gradienti di ph immobilizzati sono di solito deidratati e devono essere reidratati in opportune condizioni: Il metodo più comunemente usato prevede che i gel vengano messi a contatto con un volume (a seconda delle loro dimensioni) di una soluzione di reidratazione, cosi composta: 8 M Urea, 4-0,5 % CHAPS, 0,2 % DTT (o altri agenti riducenti), 0,5% (fino a 2% nel caso di strip da 24 cm) IPG buffer, 10% glicerolo. Fenomeno dell elettroendoosmosi: Nel caso ci siano cariche fisse sulla matrice che forma il gel, in particolare cariche negative (-), queste non possono migrare in un campo elettrico ma hanno solitamente dei contro ioni (possono essere dei cationi con la loro sfera d idratazione o stessi H 3 O + ) che migrano verso il catodo creando un vero e proprio flusso di acqua. (fenomeno che porta a dei problemi notevoli utilizzando gradienti di ph non immobilizzati, distorsione/spostamento del gradiente di ph). Il glicerolo aumenta la densità del mezzo e diminuisce/minimizza questo effetto. anodo + ph3 flusso di acqua catodo - ph10

72 Immobilized ph Gradient strip (IPG strip)

73 Rehydration loading Il campione si trova in buffer e viene diluito in rehydration buffer (calcolo di mg da utilizzare nella IEF, tutti i campioni devono essere normalizzati: stessa quantità di campione e stesse proporzione buffer/rehydration buffer nel caso questi due fossero diversi). Il campione così preparato viene lasciato 1h ad equilibrare. Il campione viene applicato nello strip holder (contenitore delle stesse dimensioni della strip serve a minimizzare volumi). Il gel viene applicato in giù in modo che si stabilisca un contatto con gli elettrodi. Il gel viene lasciato in queste condizioni per 12 h con applicata una ddp di 50 V. Dal momento che il gel era secco, esso si rigonfia alle sue dimensioni originarie e nello stesso tempo le proteine, presenti in soluzione, vengono aspirate assieme al liquido. Il voltaggio favorisce l entrata delle proteine ed il gel ha delle maglie (C e T) tali da consentire una loro agevole entrata. Il gel viene coperto con un apposito olio (cover fluid) per fare in modo che durante la corsa il campione non evapori

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78 Focalizzazione

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80 Incrementi voltaggi per isoelettrofocalizzazione Il voltaggio può essere aumentato sia in modo lineare (ramping) che in modo brusco (step and hold). Importante è impostare un amperaggio massimo per ciascuna strip (50 ma, importante impostare il n di strip che vengono corse in parallelo poiché la corrente massima sarà diversa: 1 strip 50 ma max per 2 strip 100 ma max). Termine focalizzazione: a) Strip possono essere lavate in acqua, scolate su un pezzo di carta e messe a congelare (-80 C) in un contenitore dove vengono fatte appoggiare sul loro supporto di plastica - IMPORTANTE PER NON ROVINARE IL GEL. b) possono essere trattate per la seconda dimensione.

81 Dopo Isoelettrofocalizzazione ph 4 ph 7

82 IEF su gel Standard a diversi valori di ph Std

83 Protocollo per la preparazione del gel Native IEF X 1 gel (volume ml) 7 ml di H 2 O 2 ml di acrilamide al 30% 2.4 ml di glicerolo al 50% 0.6 ml di anfoliti 50 ml di ammonio persolfato al 10 % 20 ml di TEMED Tempo di solidificazione: 1 h circa

84 SDS-PAGE IEF su gel PM 97,400 66,200 45,000 31,000 21,500 14,400 LOX-1 soia PM ~ 94,000 pi 8,8 7,5 7,0 6,0 5,0 Campione: LOX-1 di soia purificata

85 log pi Taratura standard pi 1 y = 1,149-0,01674x R= 0, ,9 0,8 0,7 0,6 0, Tempo di migrazione (min) pi fraz 6,10 F1 5,91 5,05 6,81 G1 5,93 6,76 6,24 7,08 G2 6,35 6,38 G3 5,42 6,29 G4 6,17 6,15 6,24 G5 5,46

86 HPCE: isoelettrofocusing UV - 280nm UV - 280nm UV - 280nm UV - 280nm UV - 280nm UV - 280nm UV - 280nm UV - 280nm UV - 280nm AU AU Minutes Blu lox-1 Fucsia F1 Rosso G1 Celeste G2 Verde Scuro G3 Blu scuro G4 Verde Chiaro G5 Nero LOX-1

87 Seconda dimensione: SDS-PAGE

88 Equilibratura delle IPG strip -10 minuti nel SDS-PAGE Equilibration Buffer I (6 M Urea, M Tris/HCl ph 8.8, 2% SDS, 20 % Glicerolo, 2% DTT); -10 minuti nel SDS-PAGE Equilibration Buffer II (6 M Urea, M, Tris/HCl ph 8.8, 2% SDS, 20 % Glicerolo, 2,5 % iodoacetamide -Immersione delle strisce nel tampone di corsa 1 x.

89 -Aggiunta di gel di agarosio sopra il gel di risoluzione; - Inserimento delle IPG strip. Gel di agarosio: 0.5% low melting point agarose in 1x Tris/glycine/SDS and 0.003% bromophenol blue

90 Colorazione Coomassie Brillant Blue R-250 Nitrato di Argento

91 pi ph 4 ph pi MM 1- Conalbumina di uovo di gallina BSA Actina di muscolo di bovino GAPDH di muscolo di coniglio Anidrasi carbonica di bovino Inibitore della tripsina di soia Mioglobina di cavallo

92 Schema completo di una 2D-PAGE

93 Esempio pratico di una 2D-PAGE SDS-PAGE dell omogenato di soia varietà Dolores ph SDS-PAGE dell omogenato di soia varietà Dolores PM 97,400 66,200 45,000 PM kda + pi pi , ,500 14,400 IEF omogenato di soia varietà Dolores caricato nella strip pi 4-7

94 Studio della LOX-2 in Arabidopsis thaliana, nome comune: Arabetta comune

95 Per ricercare la sequenza, peso molecolare, pi delle proteine nei database di sequenza primaria SWISS PROT (SP) o Tr EMBL nel server ExPASy Proteomics Server: Volete identificare una particolare proteina nel vostro gel 2D. Si ritaglia lo spot di interesse dal gel, e si sottopone ad analisi degli amminoacidi e a sequenziamento dell Nterminale.

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97 LOX-2 SPOT 2D-001JZ9: pi=5.08; Mw=98398 MAPPING (identification): MASS SPECTROMETRY.

98 Experimental design for protein identification analyses using MALDI-TOF-MS (mass spectrometry). Protein spots with expression profiles were excised from reference (pooled) gels from ph ranges 3 to 10 and 4 to 7. Each spot was trypsin digested, and peptides were analyses using MALDI-TOF-MS. Resultant spectra were searched against the NCBI soybean UniGene database using the MS-Fit program of Protein Prospector.

99 Tecniche elettroforetiche Vantaggi Grande capacità di separazione e risoluzione di miscele proteiche ( proteine) Riproducibilità e affidabilità dei risultati Possibilità di confronto dei dati tra laboratori differenti Capacità di rilevazione di modificazioni post-traduzionali delle proteine: Fosforilazione Glicosilazione Tagli proteolitici Possibilità costruire e/o usufruire di mappe di riferimento disponibili in rete Identificazione MIRATA di uno specifico pattern proteico cellulare

100 Tecniche elettroforetiche Svantaggi metodica lunga molto dispendiosa in termini di: tempo, costo, fatica fisica bassa capacità di risoluzione delle proteine idrofobiche scarsa risoluzione di proteine con MM > 150 kda bassa risoluzione delle proteine poco rappresentative nel campione proteico mancanza di linearità o sensibilità tra abbondanza della proteina nel campione proteico e capacità di risoluzione tramite colorazione sul gel

101 Tutorials Elettroforesi di proteine: 2D-PAGE