METODI DI SEPARAZIONE IN PROTEOMICA

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2 METODI DI SEPARAZIONE IN PROTEOMICA ELETTROFORESI DI PROTEINE INTATTE MONODIMENSIONALE BIDIMENSIONALE CROMATOGRAFIA MONODIMENSIONALE DI PROTEINE INTATTE GEL FILTRAZIONE AFFINITA CROMATOGRAFIA MONO o BIDIMENSIONALE DI PEPTIDI SCAMBIO IONICO FASE INVERSA SHOT GUN PROTEOMICS

3 Elettroforesi bidimensionale (2-D) ica analitica che consente di frazionare le proteine sulla base di due loro proprietà chimico-fisic unto isoelettrico (pi) eso molecolare (MW) ella prima dimensione ovvero nel corso dell isoelectrofocusing (IEF) le proteine, in un grad ph ed in condizioni denaturanti, migrano, sotto l azione di un campo elettrico, fino alla posizion cui il ph eguaglia il loro pi. ella seconda dimensione ovvero nel corso dell SDS-PAGE, le proteine, legate alle molecole di un tergente anionico, quale l SDS, migrano, sotto l azione di un campo elettrico, attraverso le mag l gel in base al loro solo peso molecolare.

4 Proteine, polipeptidi e peptidi sono biopolimeri aventi come unità monomeriche 20 tipi di alfa amino acidi (aa). La carica netta di una proteina o di un peptide dipende dal suo contenuto di amminoacidi e dal ph della soluzione in cui la molecola è immersa.

5 LA CHIMICA DEGLI AMMINOACIDI Gli amminoacidi (aa) sono molecole organiche che hanno almeno una funzione acida (-COOH) ed una basica (-NH 2 ). Di particolare importanza sono gli α aa, poiché sono i monomeri costituitivi delle proteine. Ad eccezione della prolina, essi presentano legato al carbonio C-α tetraedrico, un H e una catena laterale R.

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7 Struttura amminoacidi

8 Gli aa hanno diversa affinità per l acqua (idrofilicità) che dipende dalla natura del gruppo R.

9 Equilibri degli amminoacidi in soluzioni acquose Catione ph acido Ione dipolare (zwitterione) ph neutro Anione ph basico A questi equilibri vanno ovviamente aggiunti quelli relativi al gruppo R qualora esso presenti gruppi ionizzabili.

10 PUNTO ISOELETTRICO Ka HA A - + H + Ka=[H + ][A - ] [HA] Il pka corrisponde al ph in cui la concentrazione della specie protonata è uguale a quella dissociata: [HA]=[A - ] Quindi la carica netta di un composto acido/base e quindi di un aa è influenzata dal ph della soluzione in cui è immerso. Il ph al quale la carica netta di un aa (o di una proteina) è uguale a zero viene definito punto isoelettrico. La specie molecolare con carica netta=0 è detta zwitterione.

11 Il pi di una proteina Ë il valore di ph a cui la proteina assume una carica elettrica pari a 0 (ovvero Ë priva di carica).

12 Table of pk a and pi values Amino acid pka 1 pka 2 pka 3 pi Glycine Alanine Valine Leucine Isoleucine Methionine Proline Phenylalanine Tryptophan Asparagine Glutamine Serine Threonine Tyrosine Cysteine Aspartic acid Glutamic acid Lysine Arginine Histidine The pk a values and the isoelectronic point, pi, are given below for the 20 _-amino acids. pka 1 = _-carboxyl group, pk a2 = α-ammonium ion, and pk a3 = side chain group. Fattori che influenzano il valore del pi di una proteina: Composizione amminoacidica Struttura tridimensionale Modifiche post-traduzionali che introducono e/o alterano gruppi acidi o basici

13 PROTEINE ACIDE E PROTEINE BASICHE Composizione amminoacidica (Σ lys + Σ arg + Σ his ) / (Σ asp + Σ glu ) >1 sono basiche alti pi (Σ lys + Σ arg + Σ his ) / (Σ asp + Σ glu ) <1 sono acide bassi pi

14 Struttura tridimensionale Il ph locale influenza i pka e di conseguenza anche i pi

15 Alcune PTMs che modificano i pka delle catene laterali Modifiche post-traduzionali Ser, Thr, Tyr Fosforilazione Ser, Thr O-glicosilazione / Lys, Arg Metilazione Lys Ubiquitinilazione / Lys e N-terminale Acetilazione - Asn, Gln Deammidazione - Asn N-glicosilazione /

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17 RUN 2-DE, STEP BY STEP

18 RUN 2-DE STEP BY STEP

19 RUN 2-DE STEP BY STEP

20 RUN 2-DE STEP BY STEP

21 Step 1: Preparazione del campione Generalmente, una procedura efficace di preparazione del campione deve includere: La solubilizzazione riproducibile di tutte le classi proteiche, incluse quelle idrofobiche. La denaturazione delle proteine. La prevenzione dell aggregazione proteica ed il mantenimento della solubilità delle proteine durante l IEF. La prevenzione di modifiche chimiche ed enzimatiche delle proteine possibili con il processo di loro estrazione. La rimozione di altre macromolecole che possono interferire nel corso dell IEF. La solubilizzazione e la denaturazione delle proteine si ottiene mediante trattamenti specifici che utilizzano: Urea (e tiourea)(denaturanti) Tioli (riducenti) Detergenti Inibitori di proteasi.

22 Denaturazione Induce ogni singola proteina in un unica conformazione facendo in modo che abbia un unico pi. (Se una stessa proteina assume conformazioni diverse, ciascuna di esse presenterà pi diversi perchè influenzati dal particolare intorno chimico delle catene laterali). Inoltre, l azione denaturante aiuta a solubilizzare e ad inibire eventuali attività enzimatiche presenti in soluzione. UREA L urea è solitamente l agente caotropico più utilizzato, ma nel caso di proteine difficili da solubilizzare, si utilizza in miscela con la TIOUREA. Urea e tiourea rompono i ponti idrogeno intra e inter-molecolari. Normalmente, si utilizzano soluzioni di urea 8M, ma anche miscele di urea 5-8M e tiourea 2M.

23 In genere vengono utilizzati detergenti non carichi (NP-40, Triton X100, etc) o zwitterionici (CHAPS, etc). Il CHAPS è un detergente zwitterionico utilizzato per aumentare la solubilità delle proteine idrofobiche. L SDS è una molecola carica negativamente e legandosi alle proteine forma micelle detergente-proteine non consentendo una corretta focalizzazione in quanto maschera i pi. Tuttavia, esso risulta compatibile con l IEF qualora sia presente nel campione finale ad una concentrazione minore dello 0,25% e si trovi in rapporto <1/8 con detergenti non ionici o zwitterionici. NP-40 e Triton X100 sono blandi detergenti non ionici. Occorre fare attenzione alle attività

24 Degradazione Inibitori di Proteasi: Anche se le condizioni utilizzate per la preparazione del campione sono denaturanti, alcuni enzimi proteolitici riescono a rimanere attivi degradando le proteine durante le fasi che precedono la corsa elettroforetica. A tale scopo è utile includere nel tampone di estrazione / preparazione del campione degli inibitori di proteasi. Solitamente questi inibitori vengono venduti sotto forma di cocktails pronti all uso. Inibitori di Fosfatasi: 1 mm NaF 1 mm Na3VO4

25 Denaturazione di proteine contenenti ponti disolfurici AGENTI RIDUCENTI Per rompere i ponti disolfurici, si utilizzano ditiotreitolo (DTT) o tributil-fosfina (TBP). Per la maggiorparte dei casi, è sufficiente una soluzione di DTT 50mM, mentre per casi difficili è preferibile usare la TBP. AGENTE ALCHILANTE IODOACETAMMIDE

26 Piccole molecole organiche polimeriche provviste della presenza contemporanea di gruppi basici e acidi, altamente solubili e anfoteriche con un pi determinato dai suddetti gruppi ed un alto potere tamponante al loro valore di pi. Aumentano la solubilità delle proteine e prevengono interazioni proteinegel. Le miscele di anfoliti sono scelte opportunamente a seconda dell intervallo di ph usato per l isolettrofocusing B B B H 3 C CH 3 A B A A B B A B A: gruppo acidico B: gruppo basico

27 PRECIPITAZIONE Sostanze che interferiscono con l analisi in prima dimensione (IEF): 1) DNA 2) Lipidi 3) Sali 4) detergenti 5) polisaccaridi Disturbano il processo di IEF e quello di colorazione del gel. Le procedure di precipitazione rendono possibile separare la componente proteica (che precipita) dagli inquinanti (che rimangono in soluzione). Dove possibile è preferibile non adottare alcuna procedura di precipitazione poichè: 1) non è detto che l efficienza di precipitazione sia uguale per tutte le proteine => alterazione del campione 2) Non è detto che tutte le proteine precipitate siano facilmente riportabili in soluzione => alterazione del campione. Vale sempre la regola generale secondo la quale:

28 Tabella delle metodiche di precipitazione Chloroform-methanol precipitation: Suggested for low concentrated protein mixture Proteins are precipitated as pellet at the interface of a methanol-chloroform and water mixture, and then recovered after washings and centrifugation steps Because of pellet presence at the double phase interface, it could be difficult to recover with a low loss

29 PRECIPITAZIONE CON SOLVENTI ORGANICI Le proteine nella loro forma nativa presentano una superficie con un carattere prevalentemente idrofilico e un interno prevalentemente idrofobico. In un tampone fisiologico esse rimangono in soluzione grazie all acqua che forma legami idrogeno con i residui presenti sulla loro superficie. ostituendo alla soluzione fisiologica un solvente organico apolare e reservando la loro struttura terziaria (basse temperature), si fa in odo che le porzioni idrofiliche delle proteine si aggreghino e ontemporaneamente vengano esposte quelle idrofobiche. ostanzialmente si ha un effetto opposto all effetto idrofobico durante a strutturazione delle proteine. MEZZO APOLARE AGGREGAZIONE

30 RUN 2-DE STEP BY STEP

31 IL PRINCIPIO DELL IEF ph<pi Charge + Towards catode ph>pi Charge - Towards anode

32 ddp pi = pi = ph3 + + ph = ph = ph10 Una proteina dispersa in un gradiente di ph, si troverà ad avere carica netta positiva, netta negativa oppure (se si trova già ad un ph pari al suo pi) nulla. Sottoposta all azione di un campo elettrico opportunamente orientato, essa si muoverà, a seconda della sua carica verso l elettrodo di segno opposto, fino a raggiungere il ph pari al suo pi. In questo punto, essa assume carica netta nulla e non è più sottoposta all azione del campo elettrico. Se si allontana dalla regione dove ph=pi, essa assume un opportuna carica e viene nuovamente focalizzata. => Questo conferisce alta risoluzione all IEF. Più una proteina è lontana dal suo pi (in termini di ph), maggiore sarà la sua carica e dunque anche la sua mobilità elettroforetica: mano a mano che essa si avvicina al ph pari al suo pi, la sua carica netta diminuisce e di conseguenza diminuisce anche la sua mobilità elettroforetica =>per questo il processo di focalizzazione è un processo che solitamente richiede tempi lunghi!

33 L isoelettrofocalizzazione Prima e dopo IL potere risolutivo dipende dal gradiente di ph.

34 Anfoliti Possono essere generati da: Derivati dell acrilammide (IPG strip posti contenenti un numero variabile di ppi amminici e carbossilici. Ciascuna lecola ha un suo pi ed un alta capacità ponante al suo pi. Sottoposte all azione di campo elettrico migrano a seconda della pria carica netta generando un gradiente ph. SVANTAGGI gradiente non è stabile durante l analisi ed influenzabile dalle molecole che vengono lizzate. - s. acida s. basica Questi derivati dell acrilammide sono noti come Immobilines. I gruppi R possono essere gruppi carbossilici o amminici (pka da 0.8 a 4.6 / pka da 6.2 a 12). VANTAGGI - La chimica delle IPG è più controllabile. -Essendo prodotte industrialmente (GMP), sono m suscettibili a variabilità. -Sono facili da maneggiare e, grazie al fatto che s immobilizzati, i gradienti di ph sono costanti durante l I -Con le IPG, si possono caricare alti quantitativi proteine e se ne riducono le perdite durante l equilibra nell SDS buffer.

35 Le IPG strips possono avere diverse lunghezze e diversi e ristretti range di ph. sentono risoluzioni dell ordine di 0,001 unità di ph incrementando così di oltre il 30% il numero di spots alizzabili.

36 Apparecchio per IEF ( focalizzazione isoelettrica)

37 adienti di ph immobilizzati (IPG strips) sono di solito dratati e devono essere reidratati in opportune dizioni. uzione di reidratazione Urea (o in alternativa la composizione usata per il s buffer), 4-0,5 % CHAPS, 0,2 % DTT (o altri agenti centi), 0,5% (fino a 2% nel caso di strip da 24 cm) IPG fer, 10% glicerolo. Caricamento del campione Rehydration loading campione che si trova in lysis buffer viene diluito in hydration buffer e lasciato 1h ad equilibrare. ccessivamente viene caricato nello strip holder ontenitore delle stesse dimensioni della strip). Il gel ene applicato a testa in giù in modo che si stabilisca contatto con gli elettrodi e la soluzione di idratazione e viene lasciato in queste condizioni per h con applicata una ddp di 50 V. In queste ndizioni il gel che in origine era secco si rigonfia e llo stesso tempo le proteine, presenti in soluzione, ngono aspirate assieme al liquido. Il voltaggio vorisce l entrata delle proteine nel gel. La strip ene coperta con un apposito olio (cover fluid) per re in modo che durante la corsa il campione non apori. Cup loading Il gel viene reidratato senza campione seguendo una procedura analoga a quella utilizzata per il caricamento a reidratazione (rehydration loading). Al termine della reidratazione, il gel viene posizionato verso l alto in un apposita vaschetta. Sul gel, in una determinata posizione (a seconda che sia un caricamento anodico o catodico) viene collocata un apposito applicatore dentro il quale viene caricato il campione. Dopo il caricamento del campione, con il gel così posizionato, viene effettuata la corsa di IEF.

38 Incrementi dei voltaggi per isoelettrofocalizzazione Rehydratation loading Cup loading Il voltaggio può essere aumentato sia in modo lineare (ramping) che in modo brusco (step and hold) a seconda che si sia effettuato un cup o rehydration loading. Importante è impostare un amperaggio massimo per ciascuna strip (1 strip => 50 µa max - 2 strip => 100 µa max - ecc). Alla fine della corsa si applica solitamente per 15 minuti il massimo voltaggio in modo da rifocalizzare le proteine che possono essere diffuse lateralmente. Al termine della focalizzazione a) Possono essere subito trattate per la seconda dimensione. b) Possono essere congelate (-80 C) dopo lavaggi in acqua ed opportuna asciugatura su carta assorbente. La seconda dimensione può essere corsa in un secondo momento. E IMPORTANTE ESEGUIRE IN CONTEMPORANEA LE STESSE OPERAZIONI PER TUTTE LE STRIP DA CONFRONTARE!