Colonne Agilent AdvanceBio SEC per l'analisi di aggregati: compatibilità degli strumenti

Transcript

1 Colonne Agilent AdvanceBio SEC per l'analisi di aggregati: compatibilità degli strumenti Caratteristiche tecniche Introduzione Le colonne AdvanceBio SEC di Agilent sono una nuova famiglia di colonne per cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC), impaccate con particelle da,7 µm di una speciale fase stazionaria in silice rivestita di polimero, a basso legame. Questa tecnologia garantisce ime interazioni non specifiche e permette una migliore forma dei picchi per l'analisi di molecole bioterapeutiche, come anticorpi monoclonali (mab) e coniugati farmaco-anticorpo (ADC). Anche se si raccomanda di utilizzare le colonne AdvanceBio SEC con il sistema LC Agilent 16 Infinity Bio-Inert, l'elevata omogeneità delle particelle da,7 µm conferisce alla colonna un'efficienza eccellente, garantendo il massimo recupero di proteine a pressioni operative che permettono l'utilizzo di tutti i sistemi HPLC, da quelli convenzionali a bar fino agli strumenti UHPLC a 1. bar. La colonna AdvanceBio SEC 3 Å è stata progettata specificamente per l'analisi degli aggregati di anticorpi monoclonali, per fornire prestazioni ottimali dove servono, nella risoluzione di monomeri e dimeri. La colonna AdvanceBio SEC 13 Å ha un volume dei pori simile, ma è più adatta a proteine di piccole dimensioni e polipeptidi. L'ampia scelta di dimensioni delle colonne soddisfa tutte le esigenze applicative: dal diametro interno convenzionale di 7,8 mm a quello di,6 mm per una maggiore sensibilità o qualora la disponibilità di campione sia limitata. La lunghezza delle colonne è di 3 cm per le separazioni tradizionali ad alta risoluzione e di 1 cm per ottenere velocità più elevate, quando si richiede una maggiore produttività. Sono disponibili anche precolonne da cinque centimetri.

2 Tipo di strumento Strumento di HPLC Agilent 11, ( bar) Sistema quaternario Agilent 16 Infinity Bio-Inert (6 bar) Sistema LC binario Agilent 19 Infinity (1. bar) Esempio di cromatogramma Norm Norm Norm Figura 1. Esempi illustrativi di separazioni proteiche realizzate utilizzando diversi strumenti HPLC (traccia blu: miscela di standard proteici BioRad; traccia rossa: γ-globulina). Nota: Sono stati utilizzati diversi lotti di proteine in differenti laboratori. Condizioni Parametro Valore Eluente Tampone fosfato di sodio 1 mm, ph 7, Flusso Temperatura Campione Strumento Lunghezza d'onda 1, ml/ (colonne da 7,8 mm) o,3 ml/ (colonne da,6 mm) Ambiente Concentrazione proteica 1 mg/ml Strumento di HPLC Agilent 11 (obsoleto, bar) Sistema quaternario Agilent 16 Infinity Bio-Inert (6 bar) Sistema LC binario Agilent 19 Infinity con DAD G131D e cella a flusso Bio-Inert (1. bar) nm

3 Scelta del giusto diametro della colonna L'utilizzo di colonne con diametri interni differenti richiede un adeguamento del flusso (per mantenere la stessa velocità lineare) e del volume di campione. Il normale flusso operativo per le colonne da 7,8 mm è 1, ml/, quindi il giusto flusso per le colonne da,6 mm è,3 ml/. Il volume di iniezione dovrebbe essere ridotto in misura simile per ottenere una risposta del rivelatore paragonabile, quindi un'iniezione da 6 µl su una colonna da 7,8 mm corrisponde a un'iniezione da µl su una colonna da,6 mm. Potrebbero esserci lievi differenze nel tempo di ritenzione osservato, a causa del volume extracolonna dello strumento. Analogamente, la contropressione osservata in uno strumento utilizzato a 1, ml/ sarà maggiore della contropressione osservata nello stesso strumento utilizzato a,3 ml/, specialmente nel caso in cui siano stati utilizzati capillari con un basso volume morto. La figura mostra i risultati per due colonne da 3 cm con diametro di 7,8 mm e,6 mm, impaccate con lo stesso lotto di fase stazionaria e testate sullo stesso strumento quaternario Agilent 16 Infinity Bio-Inert. La figura illustra chiaramente quanto siano simili le prestazioni delle colonne. La possibilità di usare volumi di iniezione inferiori per le colonne da,6 mm rappresenta un grande vantaggio quando la disponibilità di campione è limitata, e si adatta meglio agli strumenti più moderni con un basso volume morto. Per le applicazioni che richiedono l'impiego di mau mau A Agilent AdvanceBio SEC 3 Å 7,8 3 mm 1, ml/ 1 3 rivelatori meno sensibili, come i rivelatori a dispersione, i rivelatori a indice di rifrazione e i rivelatori UV a lunghezze d onda elevate (per esempio, quando si usano fasi mobili eluenti che hanno un fondo elevato a basse lunghezze d'onda), la colonna da 7,8 mm offre la possibilità di iniettare volumi di campione superiori Aggregati della tireoglobulina. Monomero di tireoglobulina 3. Dimero di γ-globulina. Monomero di γ-globulina. Dimero di ovalbua 6. Ovalbua 7. Mioglobina 8. Vitaa B B Agilent AdvanceBio SEC 3 Å,6 3 mm,3 ml/ Figura. Confronto delle separazioni di standard proteici effettuate su colonne da 7,8 mm e,6 mm. 8 3

4 Le soluzioni tampone forti usate per l'analisi comportano un rischio di precipitazione o corrosione (se nella fase mobile sono presenti ioni cloruro). Nei tamponi acquosi che non contengono conservanti può anche verificarsi una crescita batterica. È essenziale effettuare regolarmente la manutenzione preventiva e lavare sempre gli strumenti, per evitare che rimangano al loro interno residui della soluzione tampone. L'utilizzo di soluzioni tampone preparate al momento e filtrate attraverso un filtro a membrana con pori da, µm è uno dei prerequisiti per un funzionamento affidabile. mau Iniezione Rs 1,16 (dopo giorni),16 (dopo giorni) 8, (dopo 8 giorni) 1.,19 (dopo 1 giorni) Iniezione 1 Iniezione 1. Iniezione 8 Iniezione Per queste ragioni, lo strumento ideale è il sistema quaternario Agilent 16 Infinity Bio-Inert. Garantire un'affidabilità duratura Il monitoraggio delle prestazioni della colonna è un elemento importante per una cromatografia ad esclusione dimensionale affidabile. È noto che i tamponi fosfato causano un deterioramento delle fasi stazionarie a base di silice. Le colonne AdvanceBio SEC hanno uno strato polimerico idrofilo proprietario che aiuta a ridurre al imo le interazioni non specifiche. Le colonne vengono sottoposte a test di routine per dimostrare l'affidabilità della durata della colonna anche con tamponi fosfato di sodio concentrati (figure 3 e ). La durata delle colonne può ridursi se queste vengono utilizzate ad alte temperature o a flussi più elevati. Figura 3. Esperimento di durata su una colonna Agilent AdvanceBio SEC 3 Å, 7,8 3 mm, realizzato effettuando 1. iniezioni in 1 giorni di funzionamento. % dell'area (monomero) Cambio del campione % monomero % aggregati % dimero Numero iniezioni Figura. Variazione ima delle percentuali dell'area del monomero e del dimero nel corso dell'esperimento di durata su una colonna Agilent AdvanceBio SEC 3 Å, 7,8 3 mm, effettuato in 1 giorni di lavoro % dell'area (aggregati e dimero)

5 Garantire risultati costanti da strumento a strumento e da laboratorio a laboratorio è essenziale per un trasferimento del metodo efficiente. Solo utilizzando regolarmente una miscela di standard proteici è possibile deterare se è necessario ottimizzare altri fattori oltre alla colonna. La figura mostra l'eccellente riproducibilità di strumenti strettamente correlati funzionanti in maniera corretta. Standard proteici per Agilent AdvanceBio SEC 13 Å Una miscela proteica comprendente cinque proteine accuratamente selezionate (ovalbua, mioglobina, aprotinina, neurotensina e angiotensina II) progettata per calibrare le colonne a esclusione dimensionale AdvanceBio 13 Å di Agilent. Questo standard può essere usato regolarmente per calibrare la colonna e garantisce prestazioni del sistema ideali in varie applicazioni che comportano la purificazione e l'analisi di proteine. Standard proteici per Agilent AdvanceBio SEC 3 Å Una miscela proteica comprendente cinque proteine accuratamente selezionate (tireoglobulina, γ-globulina, ovalbua, mioglobina e angiotensina II) progettata per calibrare le colonne a esclusione dimensionale AdvanceBio 3 Å di Agilent. Questo standard può essere usato regolarmente per calibrare la colonna e garantisce prestazioni del sistema ideali in varie applicazioni che comportano la purificazione e l'analisi di proteine. Risposta A HPLC Agilent serie mau B 1 Sistema quaternario Agilent 16 1 Infinity Bio Figura. Confronto di una miscela di standard proteici analizzata su colonne Agilent AdvanceBio SEC 3 Å, 7,8 3 mm, utilizzando un strumento di HPLC Agilent serie 11 e un sistema quaternario Agilent 16 Infinity Bio-Inert. 6 7 Standard proteici per Agilent AdvanceBio SEC Descrizione Dimensioni Codice 13 Å Vial da 1, ml Å Vial da 1, ml

6 In una separazione in isocratica, le differenze nel tempo di ritenzione sono dovute generalmente all'imprecisione del flusso (che potrebbe derivare da una cattiva manutenzione della pompa o dall'usura generale) o a differenze nel volume morto extra-colonna (variazioni nella lunghezza o nel diametro dei capillari o nelle dimensioni del loop di campionamento). Questo è particolarmente importante quando si trasferiscono metodi a strumenti LC di altri fornitori (figure 6 e 7). AU,3,,,1,1, AU,,,3,,1 A B Agilent AdvanceBio SEC 3 Å,,6 x 1 mm su sistema H-Class Waters (,3 ml/) n. Tempo % Area 1,8 1, 3,3 87,8 Agilent AdvanceBio SEC 3 Å, 7,8 x 3 mm su sistema Alliance Waters (1, ml/) n. Tempo % Area 1 6,39 1, 7,63 87, Figura 6. Confronto delle separazioni di γ-globulina effettuate su colonne di dimensioni diverse e strumenti differenti. AU,7 3,6, 1. Aggregati. Dimero 3. Monomero (% dell'area = 86,6%). Frammento a basso PM. Conservante,,3,, Figura 7. Quattro iniezioni replicate di γ-globulina su un sistema HPLC Alliance Waters. 6

7 Controllo della temperatura Un fattore che viene spesso trascurato quando si detera l'affidabilità di un metodo è la temperatura di separazione. Molto spesso, le separazioni vengono effettuate a temperatura ambiente; tuttavia, la normale temperatura in un particolare ambiente può dipendere dall'orario e da variazioni stagionali ed essere influenzata dal riscaldamento o dal sistema di condizionamento dell'aria. Nelle separazioni acquose, la contropressione varia notevolmente in relazione ai cambiamenti di temperatura, ma anche alcune proteine ne risentono. Ci si può aspettare un miglioramento della risoluzione con temperature crescenti; tuttavia, potrebbero esserci variazioni anche nei livelli di aggregazione (figure 8 e 9). Per questa ragione, si raccomanda vivamente di effettuare le separazioni collocando la colonna all'interno di un forno termostatato e di tenere i campioni in un ambiente a temperatura controllata. Conclusioni Le colonne Agilent AdvanceBio SEC sono state sviluppate per fornire prestazioni ottimali indipendentemente dallo strumento utilizzato. Questo documento sulle caratteristiche tecniche sottolinea alcuni degli aspetti da tenere in considerazione per ottenere risultati paragonabili su strumenti che vanno dai più datati sistemi a bar ai moderni strumenti per UHPLC, indipendentemente dalla sede e dall'operatore. mau ,,,, 6, 6, 7, 7, 8, 8, Figura 8. Effetto della temperatura di analisi della γ-globulina. % dell'area (monomero) C 167, bar Rs 1,8 % dell'area dei monomeri = 7,8% C 1,6 bar Rs 1,8 % dell'area dei monomeri = 73,9% % monomero % aggregati % dimero 1 C C C 3 C 3 C C C C C Numero iniezioni Figura 9. Effetto della temperatura di analisi sul contenuto di monomero/dimero/aggregato di γ-globulina % dell'area (aggregati e dimero) 7

8 Le informazioni fornite possono variare senza preavviso. Agilent Technologies, Inc., 16 Pubblicato negli Stati Uniti, 1 gennaio ITE