Rapporti ISTISAN 04/xxx Il campione acquoso, in un contenitore opportunamente chiuso, viene mantenuto, in un bagno ad acqua termostatato, alla tempera

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1 Rapporti ISTISAN 04/xx DETERMINAZIONE DEL BENZENE: METODO GASCROMATOGRAFICO APPLICATO ALLO SPAZIO DI TESTA STATICO E ALLO SPAZIO DI TESTA DINAMICO. 0. Generalità e definizioni Il benzene fa parte dei composti organici volatili (VOC), un ampia classe di composti caratterizzati da un elevata tensione di vapore. Il benzene ha una particolare rilevanza dal punto di vista igienico sanitario in quanto è un riconosciuto cancerogeno per la salute umana. Il benzene è utilizzato in campo industriale e nei prodotti petroliferi, in particolare, nelle benzine. La presenza del benzene nell ecosistema acquatico è legata a perdite che si possono verificare durante le fasi di trasporto e stoccaggio dei prodotti derivati dal petrolio, oppure agli scarichi industriali. 1. Campo di applicazione Le procedure analitiche descritte consentono la determinazione del benzene in acque sorgive, sotterranee e superficiali, destinate o da destinare al consumo umano. Tali procedure possono essere, inoltre, impiegate per la determinazione nelle acque di altri composti organici volatili quali i composti organoalogenati e gli idrocarburi aromatici di cui alla tabella 6200: III prevista da APHA SM 20 edizione: 1998 oppure da miscela EPA Il campo di applicazione, la sensibilità e il limite di rilevabilità del metodo dipendono dalla procedura analitica di preparazione del campione e dalle prestazioni della strumentazione utilizzata. I metodi descritti consentono la determinazione quantitativa del benzene a concentrazioni uguali o superiori a 0.1 µg/l. 2. Metodi di analisi Metodo A. Procedimento basato sulla tecnica dello spazio di testa statico. Rivelatore: Spettrometro di massa (SIM) - o altri rivelatori dopo averne verificato le prestazioni richieste dal metodo. A.2.1. Principio del metodo Il metodo permette la determinazione gascromatografica del benzene e di altri VOC mediante la tecnica dello spazio di testa statico. Il benzene e gli altri VOC sono poco solubili in acqua, pertanto, tendono ad occupare lo spazio di testa delle vials, chiuse ermeticamente, in cui è contenuto il campione acquoso. La tecnica dello spazio di testa consiste, quindi, nell analisi gascromatografica della fase vapore del campione in equilibrio termodinamico con la fase liquida. 1

2 Rapporti ISTISAN 04/xxx Il campione acquoso, in un contenitore opportunamente chiuso, viene mantenuto, in un bagno ad acqua termostatato, alla temperatura costante prescelta per un tempo sufficientemente lungo al raggiungimento dell equilibrio di ripartizione del composto in esame tra le due fasi acqua aria. La distribuzione dei composti organici volatili tra le due fasi dipende dalla temperatura, dalla tensione di vapore dei singoli composti, dall influenza della matrice del campione sui coefficienti di attività degli analiti e dal rapporto tra il volume dello spazio di testa e il volume di liquido nel vial. L aggiunta, nel campione in esame, di un sale inerte solubile, fino a saturazione, provoca un aumento della forza ionica della fase acquosa che determinando un aumento dei coefficienti di attività degli analiti ne migliora la risposta analitica influenzando la sensibilità del metodo. Inoltre, l aggiunta di un sale solubile inerte a tutte le soluzioni acquose (soluzioni di lavoro e campioni reali) riduce le differenze di forza ionica riscontrabili tra i vari campioni reali e le soluzioni di riferimento. Nel metodo proposto, il campione acquoso prelevato direttamente dal recipiente utilizzato per il prelievo, viene introdotto in contenitori di vetro di adeguato volume, in genere da 10 o 20 ml, che vengono chiusi ermeticamente con membrane siliconiche teflonate e termostatati ad una temperatura (50-80 o C) e per un tempo definiti (almeno 30 min.). Un volume determinato di fase vapore viene prelevato dal contenitore, forando la membrana teflonata, con una siringa da gas e, quindi, iniettato in un gascromatografo, munito di una colonna capillare, avente come rivelatore lo spettrometro di massa. L identificazione del benzene e degli altri VOC è fatta in base ai tempi di ritenzione dei picchi, nonché degli ioni caratteristici dei singoli componenti avendo cura di mantenere costante la portata del gas di trasporto e badando all accuratezza delle temperature del forno individuate per l analisi. Le determinazioni quantitative si basano sul confronto fra le aree dei picchi ottenuti iniettando il campione e le aree dei picchi prodotti dalle soluzioni di taratura. Il processo di prelievo, dai contenitori ermeticamente chiusi, e di iniezione della fase vapore all interno di un gascromatografo può essere completamente automatizzato mediante l impiego di un campionatore per spazio di testa. A.2.2. Interferenze e cause di errore Composti organici volatili diversi dal benzene possono avere tempi di ritenzione e ioni casualmente coincidenti con quelli del composto in esame. I loro effetti possono essere evitati o ridotti ripetendo la determinazione analitica dopo aver modificato le condizioni cromatografiche quali temperatura, lunghezza della colonna, fase stazionaria. Le colonne capillari consentono di ottenere, generalmente, una buona sensibilità ed affidabilità nella determinazione dell analita in oggetto. L uso di tali colonne permette una buona separazione dei picchi delle sostanze da analizzare da quelli delle sostanze interferenti. La separazione può essere migliorata aumentando la lunghezza della colonna, con conseguente allungamento dei tempi di analisi. Sarà opportuno trovare il miglior compromesso tra risoluzione, durata dell analisi e sensibilità. A.2.3. Campionamento e conservazione del campione Il campionamento dell acqua da analizzare è una fase importante e delicata ai fini della corretta determinazione analitica del composto in esame. Per il prelievo dell acqua si consiglia l uso di bottiglie di vetro, chiuse con un tappo a tenuta e inerte, accuratamente pulite per evitare contaminazioni del campione. Immediatamente prima del riempimento è necessario bagnare le pareti interne delle bottiglie con l acqua da analizzare. Non bisogna filtrare l acqua ed evitare ogni operazione che faciliti il degasaggio dei composti organici volatili disciolti. Riempire la bottiglia fino all orlo e tappare subito evitando di lasciare spazi gassosi nei quali possano passare i composti più volatili che andrebbero perduti all apertura della bottiglia, fornendo risultati in difetto. I campioni durante il trasporto dal luogo di prelievo al laboratorio devono essere conservati in condizioni refrigerate. Le analisi devono essere effettuate al più presto, in ogni caso entro 48 ore dal prelievo, conservando il campione in frigorifero a 4 ± 3ºC. Si deve considerare come inizio analisi il momento in cui viene riempita la vial con il campione. Il campione dovrà essere analizzato entro le 24 ore successive. 2

3 Rapporti ISTISAN 04/xx A.2.4. Strumentazione e vetreria La vetreria e i materiali impiegati devono essere dedicati alla procedura analitica in oggetto. A Bottiglie di vetro Per la raccolta del campione utilizzare bottiglie di vetro con tappo a tenuta di capacità almeno pari a 100 ml. A Flaconcini di vetro (vials) Per l analisi dello spazio di testa statico utilizzare vials adatti, di idonea capacità, con tappo con ghiera di alluminio e guarnizione in gomma siliconica teflonata, a chiusura ermetica. A Matracci tarati Di vario volume per la preparazione delle soluzioni a concentrazione nota dell analita da determinare per la preparazione delle rette di calibrazione. A Pipette tarate Di vario volume a doppia tacca, classe A. A Spatola d acciaio per pesate di sostanze solide. A Microsiringhe Per liquidi da 10, 50, 250, 500 e 1000 µl. Per il prelievo quantitativo di piccoli volumi di analita o di soluzioni si consiglia l impiego di microsiringhe tarate, lavate accuratamente con acetone e metanolo. A Microsiringhe per gas da µl. In assenza di autocampionatore per l iniezione manuale di aliquote di gas nel gascromatografo impiegare microsiringhe tarate a tenuta di gas. A Pinze Per chiusura ed aperture delle vials. A Bilancia tecnica Precisione 0,1g. A Bilancia analitica Precisione 0,1mg. A Strumentazione analitica ed accessori - Gascromatografo, dotato di un forno per le colonne capillari di sufficiente capacità. - Iniettore split/splitless, on-column o vaporizzatore a temperatura programmabile (PTV) Rivelatori. Spettrometro di massa o altri rivelatori in grado di soddisfare le prestazioni richieste nel metodo 3

4 Rapporti ISTISAN 04/xxx Colonna cromatografica capillare in silice fusa con fase stazionaria apolare o mediamente polare, di opportuna lunghezza (30 60 m) e diametro interno (250 µm), con uno spessore di fase non inferiore ad 1 µm. A Termostato Indipendente per campioni e standard, per i casi in cui il gascromatografo non sia dotato di autocampionatore termostatato. A Sistema di acquisizione dei dati cromatografici Può essere rappresentato da un computer collegato alla strumentazione mediante un interfaccia oppure da un semplice integratore. A Campionatore dello spazio di testa statico. Per la termostazione del campione e delle soluzioni di lavoro, nonché per il prelievo e la successiva iniezione dello spazio di testa si consiglia l impiego di un sistema automatico gestito da un computer o da un sistema di controllo locale. In alternativa è possibile iniettare manualmente un aliquota della fase gassosa in equilibrio con la fase acquosa utilizzando microsiringhe a tenuta di gas. A Gas di trasporto (elio o idrogeno), gas di estrazione dello spazio di testa (elio). Utilizzare gas di elevata purezza filtrati attraverso una trappola a setacci molecolari tipo 5 A. La vetreria di cui ai punti e dopo il lavaggio va trattata a ºC per almeno tre ore. I tappi e le guarnizioni vanno lavati in n-pentano e asciugati in stufa a 90ºC. Le fiale devono essere trattate di norma a 200ºC per almeno tre ore; nel caso di presenza di composti altobollenti, le fiale andranno trattate a temperature superiori, anche 400ºC, ed eventualmente con miscela cromica. Le siringhe per il campionamento dei gas devono essere flussate con un gas inerte dopo ogni iniezione. A.2.5. Reagenti Tutti i reagenti devono essere di grado analitico e con qualifiche speciali per gascromatografia. A Acqua. Per il risciacquo preliminare della vetreria può essere impiegata acqua ottenuta dalla deionizzazione o dalla distillazione di quella potabile. Per il risciacquo finale della vetreria e per la preparazione delle soluzioni di riferimento dovrà essere usata acqua ultrapura esente da composti organici. A Acetone. Utilizzare un prodotto ultrapuro. A Metanolo. Utilizzare un prodotto ultrapuro dopo aver verificato l assenza di impurezze che interferiscono con la determinazione in oggetto. 4

5 Rapporti ISTISAN 04/xx A n-pentano. Utilizzare un prodotto ultrapuro dopo aver verificato l assenza di impurezze che interferiscono con la determinazione in oggetto. A Solfato di magnesio eptaidrato o altro sale solubile inerte. Utilizzare un prodotto puro per analisi. A Benzene Di elevata purezza per la preparazione delle soluzioni di taratura. Verificare che il composto dia un solo picco cromatografico nelle condizioni di lavoro previste per le soluzioni di taratura. A Trifluorobenzene Può essere utilizzato 1-Cloro-2-Fluorobenzene, oppure un altra sostanza idonea ad essere usata quale standard interno (l utilizzo delle standard interno è comunque facoltativo) per determinazioni del benzene e di altri idrocarburi aromatici. Affinché un determinato composto possa essere utilizzato come standard interno deve rispondere a precisi requisiti come: non essere presente nei campioni reali in esame; essere stabile ed inerte nei confronti dei composti da determinare; avere un tempo di ritenzione compreso nell intervallo dei tempi di ritenzione dei composti da determinare; essere risolto gascromatograficamente rispetto alle sostanze da determinare. A Soluzioni primarie di riferimento 2,00 g/l o diversa concentrazione (scelta dall operatore in funzione delle diverse condizioni operative) A Preparazione della soluzione primaria di riferimento (2,00 g/l) del benzene La soluzione viene preparata in laboratorio a partire dal composto puro. In un matraccio tarato da 100 ml, riempito con circa 50 ml di metanolo ( ), pesare 200 mg del composto puro da dosare. Portare a volume con metanolo, omogeneizzare e conservare la soluzione al riparo dalla luce e alla temperatura di 18 ± 3 o C. La soluzione primaria di riferimento può essere sostituita da uno standard commerciale a titolo noto, certificato, del composto in esame. Come per il benzene, per ogni altro VOC che si vuole dosare si può procedere allo stesso modo per preparare la soluzione primaria di riferimento. Le soluzioni del benzene e degli altri VOC, conservati come sopra, sono stabili per 12 mesi. A Preparazione della soluzione primaria di riferimento dello standard interno. La soluzione viene preparata in laboratorio a partire dal composto puro ( ).In un matraccio tarato da 100 ml, riempito con circa 50 ml di metanolo ( ), pesare 200 mg del composto scelto come standard interno. Portare a volume con metanolo, omogeneizzare e conservare la soluzione al riparo dalla luce e alla temperatura di 18 ± 3 o C. La soluzione primaria di riferimento dello standard interno può essere sostituita da uno standard commerciale a titolo noto, certificato. 5

6 Rapporti ISTISAN 04/xxx A Soluzioni secondarie di riferimento 0,20 g/l o diversa concentrazione, scelta dall operatore in funzione delle diverse condizioni operative. A Preparazione della soluzione secondaria di riferimento del benzene (0,20 g/l) In un matraccio tarato da 1 ml, riempito con circa 0,5 ml di metanolo ( ), introdurre, con una microsiringa, 100 µl della soluzione Portare a volume con metanolo, omogeneizzare e conservare la soluzione al riparo dalla luce e alla temperatura di 18 ± 3 o C. Questa soluzione può essere preparata con un solo composto di riferimento, il benzene, oppure con la stessa modalità, con gli altri VOC che si vogliono dosare. In quest ultimo caso si ottiene una soluzione secondaria di riferimento mista, contenente più componenti di riferimento. Le soluzioni in metanolo a 200 mg/l tenute chiuse in congelatore hanno validità di un anno dal momento della preparazione. Le stesse, conservate in congelatore a 18 ± 3 C, nel momento in cui vengono messe in uso hanno validità di un mese dalla data di apertura Preparazione della soluzione secondaria di riferimento contenente lo standard interno In un matraccio tarato da 100 ml, riempito con circa 50 ml di metanolo ( ) introdurre con una microsiringa un volume noto della soluzione Portare a volume con metanolo, omogeneizzare e conservare la soluzione al riparo dalla luce e alla temperatura di 18 ± 3 o C. A Soluzioni di lavoro A Preparazione della soluzione in metanolo 500 µg/l o diversa concentrazione, La soluzione da preparare deve essere scelta dall operatore in funzione delle diverse condizioni operative. In un matraccio tarato da 2 ml, introdurre circa 1 ml di metanolo ( ) e addizionare con una microsiringa 5 µl della soluzione Portare a volume mescolando con cura. Questa soluzione deve essere preparata ogni giorno Preparazione delle soluzioni di lavoro per la calibrazione Preparare almeno tre diverse soluzioni di riferimento in acqua aggiungendo volumi diversi della soluzione in un volume noto di acqua ( ).Le soluzioni di lavoro, da cui ricavare le rette di taratura per i singoli composti da dosare, vanno preparate in modo che le quantità degli analiti eventualmente presenti nei campioni reali cadono nel range di concentrazione prescelto. La procedura analitica descritta consente la determinazione quantitativa del benzene a concentrazioni superiori o almeno pari 0,1 µg/l. Poiché in base all Allegato III del Decreto Legislativo 2 febbraio 2001, n. 31 (Attuazione della direttiva 98/83/CE relativa alla qualità delle acque destinate al consumo umano) il metodo impiegato per la determinazione quantitativa del benzene nelle acque deve essere in grado di rispettare la specifica del limite di rivelabilità pari a 0,25 µg/l, è necessario preparare un opportuna soluzione per verificare che la procedura analitica prescelta e l apparecchiatura impiegata consentano il raggiungimento di tale specifica. Le soluzioni di lavoro devono essere preparate immediatamente prima dell impiego. A Procedura di misura A Operazioni preliminari Predisporre il gascromatografo al funzionamento seguendo le indicazioni descritte nel manuale fornito dalla casa costruttrice. Dopo aver installato la colonna cromatografica, idonea 6

7 Rapporti ISTISAN 04/xx all esecuzione della procedura analitica, regolare il flusso del gas di trasporto e programmare la temperatura del forno (oven) per effettuare diversi cicli di condizionamento della colonna senza superare la temperatura limite consigliata nelle specifiche tecniche della colonna. Prima di procedere all analisi delle soluzioni di riferimento e dei campioni ottimizzare le condizioni operative (programma della temperatura dell oven, temperatura dell iniettore e rivelatore, flusso del gas di trasporto e rapporto di splittaggio) in funzione della colonna cromatografia, dell iniettore, del rivelatore e del sistema di preconcentrazione impiegati. Predisporre, nel caso venga impiegato un campionatore di spazio di testa automatico, il sistema al funzionamento seguendo le indicazioni descritte nel manuale fornito dalla casa costruttrice. Ottimizzare le condizioni operative (temperatura del bagno termostatato, della valvola di campionamento e della transfer line, del volume del vial e del campione, tempo di termostatazione del vial) in funzione del dispositivo utilizzato e dei composti da esaminare. A Calibrazione Analizzare ciascuna soluzione di lavoro ( ) applicando il procedimento di seguito descritto. Introdurre 5 ml della soluzione acquosa di lavoro da analizzare in un vial da 10 ml ed aggiungere 6 g di solfato di magnesio eptaidrato (oppure un altro sale solubile inerte). Nel caso in cui si applichi il metodo dello standard interno aggiungere un aliquota, nota e costante, della soluzione di riferimento ( ) E necessario un dosaggio del volume di standard interno estremamente riproducibile al fine di ottenere la medesima concentrazione in tutte le soluzioni. Chiudere la vial ermeticamente, agitare vigorosamente per favorire la dissoluzione del sale e termostatare alla temperatura prescelta (50-80 C) e per il tempo predeterminato (non inferiore ai 30 min.). Prelevare un aliquota, nota e costante ( µl), della fase vapore all interno del vial, utilizzando una microsiringa a tenuta di gas, preriscaldata alla temperatura del bagno termostatato, ed iniettare in un gascromatografo. Le microsiringhe dopo ogni iniezione devono essere flussate con un gas inerte per rimuovere eventuali residui. La fase di termostatazione del vial, contenente il campione, e le successive operazioni di prelievo ed iniezione della fase gassosa possono essere automatizzate impiegando un campionatore dello spazio di testa statico. Le condizioni sopra descritte relative alla temperatura e al tempo di termostatazione, alla quantità della fase gassosa da prelevare hanno carattere esemplificativo e potranno essere ottimizzate dagli operatori in funzione della strumentazione disponibile e della matrice analizzata. Tracciare i grafici di taratura per tutti i composti in esame riportando in ascissa i valori delle concentrazioni, µg/l, dei composti presenti nelle soluzioni acquose di lavoro ed in ordinata i valori medi dell area o dell altezza dei corrispondenti picchi cromatografici. Se è stato utilizzato il metodo dello standard interno, riportare in grafico, per ogni composto la sua concentrazione in funzione del rapporto tra l area o l altezza del corrispondente picco cromatografico e l area o l altezza dello standard interno. La rivelazione gascromatografica dei composti contenuti nelle soluzioni di calibrazione viene effettuata mediante lo spettrometro di massa impiegando la tecnica SIM, nel caso del benzene vengono usati per la determinazione quali - quantitativa gli ioni 78 (ione target), 77 e 50. A Dosaggio del campione Eseguire l analisi dei campioni di acqua seguendo la procedura applicando le stesse condizioni operative utilizzate per la costruzione delle curve di taratura. Nel caso in cui si applichi il metodo dello standard interno aggiungere un aliquota della soluzione , in modo che la concentrazione finale della sostanza introdotta sia pari a quella aggiunta alle soluzioni acquose di calibrazione. L analisi gascromatografica di ogni campione va ripetuta su una diversa aliquota nei casi di superamento dei valori limite stabiliti dalla normativa. Identificare i diversi composti presenti nel campione confrontando i tempi di ritenzione dei 7

8 Rapporti ISTISAN 04/xxx picchi presenti nel cromatogramma del campione e delle soluzioni di taratura (nel caso dell apparecchiatura GC/MS l identificazione va fatta anche con gli ioni caratteristici dei singoli componenti) acquisiti nelle stesse condizioni cromatografiche. Misurare le aree di ciascun picco nei cromatogrammi ottenuti e calcolare la concentrazione di ciascun composto identificato tramite il confronto con le rette di taratura. Verificare giornalmente, utilizzando almeno una delle soluzioni acquose di lavoro ( ) ad una concentrazione all interno del campo di misura e posta a fine sequenza (controllo di batch) che la concentrazione degli analiti letta sulla curva di taratura rientri nell intervallo determinato considerando l incertezza stimata. Periodicamente verificare anche la ripetibilità del metodo effettuando in doppio il controllo di batch. La differenza in valore assoluto dei due risultati, deve essere minore o uguale al limite di ripetibilità calcolato su un numero elevato di prove o comunque come la normativa vigente in materia richiede. La rivelazione gascromatografica dei composti contenuti nei campioni reali viene effettuata mediante lo spettrometro di massa impiegando la tecnica SIM, nel caso del benzene vengono usati per la determinazione quali quantitativa gli ioni 78 (ione target), 77 e 50. A Controllo del bianco Periodicamente è necessario controllare la qualità dell ambiente di lavoro e dei reagenti impiegati sottoponendo un aliquota di acqua ( ) all intero processo analitico nelle stesse condizioni sperimentali adottate durante l analisi dei campioni e delle soluzioni di lavoro. Se le concentrazioni del benzene o di altri composti volatili nel bianco sono elevate è necessario individuare la causa di contaminazione prima di riprendere le determinazioni analitiche. Generalmente la verifica del bianco viene effettuata ad ogni inizio di sequenza delle analisi ed immediatamente dopo l analisi delle soluzioni di taratura. A Calcolo ed espressione dei risultati A Calcolo della concentrazione mediante il metodo dello standard esterno Costruire le rette di taratura per i singoli analiti, accertandosi di operare nel campo di linearità dello strumento, riportando in grafico l area del picco del composto (A) in funzione della concentrazione del composto stesso ed interpolando i punti sperimentali con il metodo dei minimi quadrati. Ricavare il coefficiente angolare (a) e l intercetta (b) della retta di taratura. A Calcolo della concentrazione mediante il metodo dello standard interno Nel caso in cui si utilizzi lo standard interno, riportare in grafico il rapporto area picco composto/area picco standard interno (A/A si ) in funzione della concentrazione del composto stesso. Accertarsi che la concentrazione del campione sia all interno dell intervallo di concentrazione utilizzato per la curva di taratura. A Espressione dei risultati La concentrazione del benzene o di altri VOC nel campione va espressa utilizzando unità di misura in accordo con la normativa vigente. 8

9 Rapporti ISTISAN 04/xx A Prestazione del metodo Le prestazioni del metodo proposto (accuratezza, precisione e limite di rivelabilità) verranno stabilite al termine delle prove di intercalibrazione. Metodo B. Procedimento basato sulla tecnica dello spazio di testa dinamico purge and trap. Rivelatore: Spettrometro di massa o altri rivelatori, quali PID o FID, dopo averne verificato le prestazioni richieste dal metodo. B.2.1. Principio del metodo Il metodo permette la determinazione gascromatografica del benzene e di altri VOC mediante la tecnica dello spazio di testa dinamico purge and trap. Il benzene e gli altri VOC, poco solubili in acqua, possono essere estratti dalla matrice acquosa attraverso il gorgogliamento di un gas inerte in un determinato volume di campione (purging). I composti così estratti vengono intrappolati in un apposito materiale adsorbente (trapping). Terminata l estrazione, la trappola viene riscaldata e gli analiti trascinati da un flusso di gas inerte in testa alla colonna cromatografica, separati e quindi rivelati. Successivamente gli analiti vengono identificati mediante i tempi di ritenzione e gli ioni caratteristici dei singoli componenti (nel caso di utilizzo di uno spettrometro di massa) e quantificati in modo del tutto analogo al metodo precedente. Il recupero del composto in esame dal campione acquoso dipende dalla temperatura della fase liquida, dalla sua tensione di vapore e dal tempo di purge. B.2.2. Interferenze e cause di errore Composti organici volatili diversi dal benzene possono avere tempi di ritenzione e ioni casualmente coincidenti con quelli del composto in esame. I loro effetti possono essere evitati o ridotti ripetendo la determinazione analitica dopo aver modificato le condizioni cromatografiche quali temperatura, lunghezza della colonna, fase stazionaria. Le colonne capillari consentono di ottenere, generalmente, una buona sensibilità ed affidabilità nella determinazione dell analita in oggetto. L uso di tali colonne permette una buona separazione dei picchi delle sostanze da analizzare da quelli delle sostanze interferenti. La separazione può essere migliorata aumentando la lunghezza della colonna, con conseguente allungamento dei tempi di analisi. Sarà opportuno trovare il miglior compromesso tra risoluzione, durata dell analisi e sensibilità. B.2.3. Campionamento e conservazione del campione Il campionamento dell acqua da analizzare è una fase importante e delicata ai fini della corretta determinazione analitica dei composti in esame. Per il prelievo dell acqua si consiglia l uso di bottiglie di vetro, chiuse con un tappo a tenuta e inerte, accuratamente pulite per evitare contaminazioni del campione. Immediatamente prima del riempimento e necessario bagnare le pareti interne delle bottiglie con l acqua da analizzare. Non bisogna filtrare l acqua ed evitare ogni operazione che faciliti il degasaggio dei composti organici volatili disciolti. Riempire la bottiglia fino all orlo e tappare subito evitando di lasciare spazi gassosi nei quali possano passare i composti più volatili che andrebbero perduti all apertura della bottiglia, fornendo risultati in difetto. I campioni durante il trasporto dal luogo di prelievo al laboratorio devono essere conservati in condizioni refrigerate. 9

10 Rapporti ISTISAN 04/xxx Le analisi devono essere effettuate al più presto, in ogni caso entro 48 ore dal prelievo, conservando il campione in frigorifero a 4 ± 3ºC. Si deve considerare come inizio analisi il momento in cui viene riempita la vial con il campione. Il campione deve essere analizzato entro le 24 ore successive. B.2.4. Strumentazione e vetreria La vetreria e i materiali impiegati devono essere riservati alla procedura analitica in oggetto. B Bottiglie di vetro Per la raccolta del campione utilizzare bottiglie di vetro con tappo a tenuta di capacità almeno pari a 100 ml. B Flaconcini di vetro (vials) Vials di idonea capacità, con chiusura vite e guarnizione in teflon B Matracci tarati Di vario volume per la preparazione delle soluzioni a concentrazione nota dell analita da determinare per la preparazione delle rette di calibrazione. B Pipette tarate Di vario volume a doppia tacca, classe A. B Microsiringhe Per liquidi da 10, 50, 250, 500 e 1000µL. Per il prelievo quantitativo di piccoli volumi di analita o di soluzioni si consiglia l impiego di microsiringhe tarate, lavate accuratamente con acetone e metanolo. B Bilancia analitica Precisione 0,1mg. B Strumentazione analitica ed accessori Gascromatografo, dotato di un forno per le colonne capillari di sufficiente capacità. Rivelatore. Spettrometro di massa o altri rivelatori in grado di soddisfare le prestazioni richieste dal metodo. Colonna cromatografica capillare in silice fusa con fase stazionaria apolare o mediamente polare, di opportuna lunghezza (30 60 m) e diametro interno (250 µm), con uno spessore di fase non inferiore ad 1 µm. B Sistema di acquisizione dei dati cromatografic.i Può essere rappresentato da un computer collegato alla strumentazione mediante un interfaccia oppure da un semplice integratore. B Campionatore Purge and trap. L analisi mediante purge and trap può essere effettuata utilizzando un dispositivo automatico gestito da un computer o da un sistema di controllo locale. Il sistema è costituito da un unità che consente l estrazione dalla fase acquosa dei composti organici volatili (purging device), da 10

11 Rapporti ISTISAN 04/xx una trappola adsorbente, da un desorbitore termico e da una linea di trasferimento termostatata (transfer line) degli analiti desorbiti in testa alla colonna cromatografica in un gascromatografo. B Gas di trasporto(elio o idrogeno), gas di estrazione dello spazio di testa (elio). Utilizzare gas di elevata purezza filtrati attraverso una trappola a setacci molecolari tipo 5 A. B Idrogeno o aria puri per gascromatografia Usati come combustibile e comburente per il rivelatore a ionizzazione di fiamma di idrogeno, eventualmente purificati attraverso trappole a setacci molecolari tipo 5 A. La vetreria di cui ai punti e dopo il lavaggio va trattata a ºC per almeno tre ore. I tappi e le guarnizioni vanno lavati in n-pentano e asciugati in stufa a 90ºC. Le fiale devono essere trattate di norma a 200ºC per almeno tre ore; nel caso di presenza di composti altobollenti, le fiale andranno trattate a temperature superiori, anche 400ºC, ed eventualmente con miscela cromica. B.2.5. Reagenti Tutti i reagenti devono essere di grado analitico e con qualifiche speciali per gascromatografia. B Acqua. B Risciacquo preliminare Per il risciacquo preliminare della vetreria può essere impiegata acqua ottenuta dalla deionizzazione o dalla distillazione di quella potabile. B Risciacquo finale Per il risciacquo finale della vetreria e per la preparazione delle soluzioni di riferimento dovrà essere usata acqua ultrapura esente da composti organici. B Acetone. Utilizzare un prodotto ultrapuro. B Metanolo. Utilizzare un prodotto ultrapuro dopo aver verificato l assenza di impurezze che interferiscono con la determinazione in oggetto. B n-pentano. Utilizzare un prodotto ultrapuro dopo aver verificato l assenza di impurezze che interferiscono con la determinazione in oggetto. B Benzene Di elevata purezza per la preparazione delle soluzioni di taratura. Verificare che il composto dia un solo picco cromatografico nelle condizioni di lavoro previste per le soluzioni di taratura. 11

12 Rapporti ISTISAN 04/xxx B Trifluorobenzene, Può essere alternativamente utilizzato 1-Cloro-2-Fluorobenzene, oppure un altra sostanza idonea ad essere usata quale standard interno per determinazioni del benzene e di altri idrocarburi aromatici. Affinchè un determinato composto possa essere utilizzato come standard interno (in ogni caso facoltativo) deve rispondere a precisi requisiti come: non essere presente nei campioni reali in esame; essere stabile ed inerte nei confronti dei composti da determinare; avere un tempo di ritenzione compreso nell intervallo dei tempi di ritenzione dei composti da determinare; essere risolto gascromatograficamente rispetto alle sostanze da determinare. B Soluzioni primarie di riferimento 2,00 g/l Può essere utilizzata una diversa concentrazione scelta dall operatore in funzione delle diverse condizioni operative B Preparazione della soluzione primaria di riferimento 2,00 g/l. La soluzione viene preparata in laboratorio a partire dal composto puro. In un matraccio tarato da 100 ml, riempito con circa 50 ml di metanolo ( ), pesare 200 mg del composto puro da dosare. Portare a volume con metanolo, omogeneizzare e conservare la soluzione al riparo dalla luce e alla temperatura di 18 ± 3 o C. La soluzione primaria di riferimento può essere sostituita da uno standard commerciale a titolo noto, certificato, del composto in esame. Come per il benzene, per ogni altro VOC che si vuole dosare si può procedere allo stesso modo per preparare la soluzione primaria di riferimento. Le soluzioni del benzene e degli altri VOC, conservati come sopra, sono stabili per 12 mesi. B Preparazione della soluzione primaria di riferimento dello standard interno. La soluzione viene preparata in laboratorio a partire dal composto puro ( ). In un matraccio tarato da 100 ml, riempito con circa 50 ml di metanolo ( ), pesare 200 mg del composto scelto come standard interno. Portare a volume con metanolo, omogeneizzare e conservare la soluzione al riparo dalla luce e alla temperatura di 18 ± 3 o C.. La soluzione primaria di riferimento dello standard interno può essere sostituita da uno standard commerciale a titolo noto, certificato. B Soluzioni secondarie di riferimento 0,20 g/l Può essere utilizzata una diversa concentrazione scelta dall operatore in funzione delle diverse condizioni operative B Preparazione della soluzione secondaria di riferimento del benzene 0,20 g/l. In un matraccio tarato da 1 ml, riempito con circa 0,5 ml di metanolo ( ), introdurre con una microsiringa 100 µl della soluzione Portare a volume con metanolo, omogeneizzare e conservare la soluzione al riparo dalla luce e alla temperatura di - 18 ± 3 o C. Questa soluzione può essere preparata con un solo composto di riferimento, il benzene, oppure con la stessa modalità, con gli altri VOC che si vogliono dosare. In quest ultimo caso si ottiene una soluzione secondaria di riferimento mista, contenente più componenti di riferimento. Le soluzioni, in metanolo, di 200 mg/l tenute chiuse e conservate in congelatore a 18 ± 3 C, hanno validità di 1 anno dal momento della preparazione. Le stesse, conservate in congelatore a 18 ± 3 C hanno validità di 1 mese dalla data di apertura. 12

13 Rapporti ISTISAN 04/xx B Preparazione della soluzione secondaria di riferimento contenente lo standard interno In un matraccio tarato da 1 ml, riempito con circa 0,5 ml di metanolo ( ) introdurre con una microsiringa un volume noto della soluzione Portare a volume con metanolo, omogeneizzare e conservare la soluzione al riparo dalla luce e alla temperatura di 18 ± 3 o C. B Soluzioni di lavoro B Preparazione della soluzione diluita in metanolo 500 ug/l, Può essere utilizzata alternativamente una diversa concentrazione scelta dall operatore in funzione delle diverse condizioni operative. In un matraccio tarato da 2 ml, introdurre circa 1 ml di metanolo ( ) e addizionare con una microsiringa 5 µl della soluzione Portare a volume mescolando con cura. Questa soluzione deve essere preparata ogni giorno. B Preparazione delle soluzioni di lavoro per la calibrazione Preparare almeno tre diverse soluzioni di riferimento in acqua aggiungendo volumi diversi della soluzione B in un volume noto di acqua ( ).Le soluzioni di lavoro, da cui ricavare le rette di taratura per i singoli composti da dosare, vanno preparate in modo che le quantità degli analiti eventualmente presenti nei campioni reali cadono nel range di concentrazione prescelto. La procedura analitica descritta consente la determinazione quantitativa del benzene a concentrazioni superiori o almeno pari 0,1µg/L. Poiché in base all Allegato III del Decreto Legislativo 2 febbraio 2001, n. 31 (Attuazione della direttiva 98/83/CE relativa alla qualità delle acque destinate al consumo umano) il metodo impiegato per la determinazione quantitativa del benzene nelle acque deve essere in grado di rispettare la specifica del limite di rivelabilità pari a 0,25 µg/l, è necessario preparare un opportuna soluzione per verificare che la procedura analitica prescelta e l apparecchiatura impiegata consentano il raggiungimento di tale specifica. Le soluzioni di lavoro devono essere preparate immediatamente prima dell impiego. B.2.6. Procedura di misura B Operazioni preliminari Predisporre il gascromatografo al funzionamento seguendo le indicazioni descritte nel manuale fornito dalla casa costruttrice. Dopo aver installato la colonna cromatografica, idonea all esecuzione della procedura analitica, regolare il flusso del gas di trasporto e programmare la temperatura del forno (oven) per effettuare diversi cicli di condizionamento della colonna senza superare la temperatura limite consigliata nelle specifiche tecniche della colonna. Prima di procedere all analisi delle soluzioni di riferimento e dei campioni ottimizzare le condizioni operative (programma della temperatura dell oven, temperatura dell iniettore e rivelatore, flusso del gas di trasporto e rapporto di splittaggio) in funzione della colonna cromatografia, del rivelatore e del sistema di preconcentrazione impiegati. Condizionare termicamente la trappola facendo contemporaneamente fluire il gas di pulizia per un periodo di tempo sufficiente per eliminare eventuali composti contaminanti. Predisporre l apparecchiatura al funzionamento seguendo le indicazioni descritte nel manuale fornito dalla casa costruttrice. Ottimizzare le condizioni operative (temperatura del campione, della trappola e della transfer line, del volume del vial e del campione, pressione e flusso del gas durante 13

14 Rapporti ISTISAN 04/xxx l intrappolamento e il desorbimento) in funzione del dispositivo utilizzato e dei composti da esaminare. B Calibrazione Analizzare ciascuna soluzione di lavoro ( ) applicando il procedimento di seguito descritto. Introdurre il volume prescelto della soluzione acquosa di lavoro da analizzare direttamente, o mediante autocampionatore, nel dispositivo Purge and trap. Nel caso in cui si applichi il metodo dello standard interno aggiungere un aliquota, nota e costante, della soluzione Attivare il dispositivo che consente l estrazione, l intrappolamento, il desorbimento e la eventuale criofocalizzazione dei composti volatili, dalla soluzione presente nel recipiente di estrazione, alla testa della colonna cromatografica. Le condizioni di lavoro per l analisi mediante spazio di testa dinamico possono essere ottimizzate dagli operatori in funzione della strumentazione disponibile e della matrice analizzata. In tab1 vengono descritte, a titolo esemplificativo, le condizioni operative tipiche per l analisi mediante spazio di testa dinamico. Tracciare i grafici di taratura per tutti i composti in esame riportando in ascissa i valori delle concentrazioni, µg/l, dei composti presenti nelle soluzioni acquose di lavoro ed in ordinata i valori medi dell area o dell altezza dei corrispondenti picchi cromatografici. Se è stato utilizzato il metodo dello standard interno, riportare in grafico, per ogni composto la sua concentrazione in funzione del rapporto tra l area o l altezza del corrispondente picco cromatografico e l area o l altezza dello standard interno. Per la rivelazione del benzene e di altri VOC contenuti nelle soluzioni di calibrazione possono essere impiegati rivelatori quali lo spettrometro di massa (quadrupolo, trappola ionica o di altri rivelatori indicati al punto 2.2). A secondo del tipo di rivelatore utilizzato dovranno essere ottimizzate le condizioni operative. Tab.1 Condizioni operative tipiche per l analisi mediante spazio di testa dinamico Temperatura iniziale trappola Un temperatura bassa (meglio se <0ºC, comunque non >25ºC) garantisce una migliore possibilità di intrappolamento per gli analiti, soprattutto quelli più volatili Purge In questa fase il gas passa attraverso il campione, contenuto in apposita ampolla e gorgoglia alcuni minuti trasferendo gli analiti alla trappola; tempo di gorgogliamento consigliato: 12 minuti; flusso 40 ml/min Dry Purge Desorb preheat Serve a rimuovere l acqua o l eventuale umidità dalla trappola. Durata: circa 2 minuti E usato per riscaldare la trappola ad alta temperatura in modo che gli analiti vengano rilasciati dall adsorbente: in questa fase non vi è flusso di gas; temperatura consigliata 235ºC Desorbimento Pulizia Trappola Gli analiti vengono desorbiti dalla trappola da parte del carrier gas e trasferiti al gascromatografo; in questa fase, della durata di circa 4 minuti, la temperatura consigliata è di 245ºC In questa fase, in cui il gas passa attraverso il sistema per rimuovere eventuali residui di analiti e tracce di umidità rimaste nel sistema, la trappola è portata ad alta temperatura (260ºC) per un tempo di almeno 10 minuti. Dopo questa fase si ritorna alle condizioni di stand by Tenax oppure carbone o altri materiali adsorbenti o loro miscele B Dosaggio del campione Eseguire l analisi dei campioni di acqua seguendo la procedura applicando le stesse condizioni operative utilizzate per la costruzione delle curve di taratura. Nel caso in cui si applichi il metodo dello standard interno aggiungere un aliquota della soluzione in modo che la concentrazione finale della sostanza introdotta sia pari a quella aggiunta alle soluzioni acquose di calibrazione. 14

15 Rapporti ISTISAN 04/xx L analisi gascromatografica di ogni campione va ripetuta su una diversa aliquota nei casi di superamento dei valori limite stabiliti dalla normativa. Identificare i diversi composti presenti nel campione confrontando i tempi di ritenzione dei picchi presenti nei cromatogrammi del campione e delle soluzioni di taratura, (nel caso dell utilizzo dell apparecchiatura GC/MS l identificazione va fatta anche con gli ioni caratteristici dei singoli componenti) acquisiti nelle stesse condizioni cromatografiche. Misurare le aree di ciascun picco nei cromatogrammi ottenuti e calcolare la concentrazione di ciascun composto identificato tramite il confronto con le rette di taratura. Verificare giornalmente, utilizzando almeno una delle soluzioni acquose di lavoro (per esempio ) ad una concentrazione all interno del campo di misura e posta a fine sequenza (controllo di batch), che la concentrazione degli analiti letti sulla curva di taratura rientri nell intervallo determinato considerando l incertezza stimata. Periodicamente verificare anche la ripetibilità del metodo effettuando in doppio il controllo di batch. La differenza in valore assoluto dei due risultati, deve essere minore o uguale al limite di ripetibilità calcolato su un numero elevato di prove o comunque come la normativa vigente in materia richiede. Per la rivelazione dei composti volatili contenuti nel campioni reali possono essere impiegati rivelatori quali lo spettrometro di massa (quadrupolo o trappola ionica) o altri indicati al punto 2.2. A secondo del tipo di rivelatore utilizzato dovranno essere ottimizzate le condizioni operative. B Controllo del bianco Periodicamente e necessario controllare la qualità dell ambiente di lavoro e dei reagenti impiegati sottoponendo un aliquota di acqua ( ) all intero processo analitico nelle stesse condizioni sperimentali adottate durante l analisi dei campioni e delle soluzioni di lavoro. Se le concentrazioni del benzene o di altri composti volatili nel bianco sono elevate è necessario individuare la causa di contaminazione prima di riprendere le determinazioni analitiche. Generalmente la verifica del bianco viene effettuata ad ogni inizio di sequenza delle analisi ed immediatamente dopo l analisi delle soluzioni di taratura. B.2.7. Calcolo ed espressione dei risultati B Calcolo della concentrazione mediante il metodo dello standard esterno Costruire le rette di taratura per i singoli analiti, accertandosi di operare nel campo di linearità dello strumento, riportando in grafico l area del picco del composto (A) in funzione della concentrazione del composto stesso ed interpolando i punti sperimentali con il metodo dei minimi quadrati. Ricavare il coefficiente angolare (a) e l intercetta (b) della retta di taratura. B Calcolo della concentrazione mediante il metodo dello standard interno Nel caso in cui si utilizzi lo standard interno, riportare in grafico il rapporto aera picco composto/area picco standard interno (A/A si ) in funzione della concentrazione del composto stesso. Accertarsi che la concentrazione del campione sia all interno dell intervallo di concentrazione utilizzato per la curva di taratura. B Espressione dei risultati La concentrazione del benzene o di altri idrocarburi aromatici nel campione va espressa utilizzando unità di misura in accordo con la normativa vigente (µg/l). 15

16 Rapporti ISTISAN 04/xxx B.2.8 Prestazione del metodo Le prestazioni del metodi proposti (accuratezza, precisione e limite di rivelabilità) verranno stabilite al termine delle prove di intercalibrazione. Bibliografia APHA, AWWA, WEF (1998): Standard methods for the examination of water and wastewater, XX Ed., (APHA, Washington). U.S. Environmental Protection Agency (1991): Volatile organic compounds in water by purge and trap capillary column gas cromatography with photoionization and electronica conductivity deterctors in series. Method in Methods for the determination of organic compounds in finishing drinking water and raw source water. U.S Environmental Protection Agency, Environmental Monitoring and Support Lab., Cincinnati, Ohio. 16