26a. Ammine aromatiche

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1 Maggio a. Ammine aromatiche 26a.1. Principio del metodo II metodo si basa sull'analisi tramite cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) di un estratto organico, ottenuto da un campione di fango o di rifiuto solido, utilizzando un rivelatore UV a lunghezza d'onda variabile, selettivo per i composti aromatici (vedi nota). 26a.2.Campo di applicazione La risposta del detector dipende dal numero e dal tipo dei sostituenti presenti nelle animine aromatiche. Per i 22 composti in analisi si possono determinare concentrazioni minime dell'ordine di 100 µg/kg. 26a.3. Interferenze Composti organici, con tempi di ritenzione coincidenti con quelli dei composti in esame, possono dare interferenze. In questo caso occorre procedere ad una purificazione tramite cromatografia su colonna multistrato dell'estratto organico, come indicato in appendice 3. 26a.4. Campionamento e conservazione del campione II prelievo e la conservazione del campione devono essere effettuati in accordo con quanto previsto dai "Metodi di campionamento dei fanghi e rifiuti solidi". Quaderni IRSA 64, Appendice I. Poiché alcune ammine aromatiche sono facilmente degradabili i campioni vanno conservati tal quali al buio in frigorifero ed estratti entro 48 ore oppure congelati a -20 C. 26a.5. Apparecchiatura Normale attrezzatura da laboratorio. 26a.5.1. Flaconi in vetro, con tappo ermetico rivestito in politetrafluo-roetilene. 26a.5.2. Microsiringhe per liquidi. 26a.5.3 Cromatografo liquido ad alte prestazioni (HPLC) dotato di rivelatore UV a lunghezza d'onda variabile, due pompe e sistema di integrazione e calcolo. 26a.5.4 Colonna cromatografica di lunghezza 250mm, diametro interno 4.6 mm, riempimento tipo spherisorb S5 OD S2 con granulometria 5 µm. 26a.5.5 Iniettore calibrato da 20 µl. 26a.5.6 Bagno a ultrasuoni termostatato. 26a.5.7 Evaporatore rotante. 26a.5.8 Colonnina in vetro da 1 cm di diametro, lunga 45 cm, con serbatoio da 50 ml dotata di setto poroso GØ e rubinetto in teflon (da usare solo per la purificazione app. 3). Nota: può essere anche impiegato un rivelatore UV a lunghezza d'onda fìssa a 245 nm. Le condizioni operative sono riportate in appendice n. 4.

2 26a.6 Reattivi Per la preparazione delle soluzione di taratura devono essere impiegati reagenti di purezza superiore al 98%. Inoltre occorre utilizzare acqua bidistillata o tipo I (Standard Methods) 26a.6.1 Acetonitrile per HPLC. 26a.6.2 Cloroformio per pesticidi. 26a.6.3 Alcol metilico per pesticidi. 26a.6.4 Toluene per pesticidi purificato per passaggio su florisil. 26a.6.5 n-esano per pesticidi. 26a.6.6 Metilene cloruro per pesticidi. 26a.6.7 Sodio solfato anidro, purificato con CH 2 Cl 2. 26a.6.8 Sodio carbonato anidro, purificato con CH 2 Cl 2. 26a.6.9 Allumina acida secondo Brockmann per cromatografia, purificata con CH 2 Cl 2. 26a.6.10 Acido acetico glaciale. 26a.6.11 Sodio acetato anidro. 26a.612 Soluzione di HC1 0.1 M. 26a.6.13 Ammine aromatiche per la calibrazione del metodo: m-fenilen-diammina, p-anisidina, Benzidina, p-nitroanilina, o-anisidina, p- Toluidina, o-toluidina, S^^dimetossi-Benzidina, p-cloroanilina, S^dimetil-Benzidina, pcloroanilina, 2-Naftilammina, 2-Cloro, 5-nitro-Anilina, 4-Cloro, 2- nitroanilina, 3,4-dicloroAnilina, 2,4-diCloroAnilina, n,n-dimetilanilina, S^klicloroBenzidina, 2,4,5-tricloroAnilina, difenil-ammina, n,n-dietilanilina. Verificare che ogni composto presenti un solo picco cromatografico nelle condizioni di lavoro previste per la taratura. 26a.6.14 Acido citrico (appendice 4). 26a.6.15 Sodio idrossido (appendice 4). 26a.6.16 Sodio cloruro (appendice 4). 26a.7 Preparazione della soluzione di taratura In considerazione della composizione molto variabile dei campioni da analizzare è opportuno preparare soluzioni di taratura di singoli composti e non di miscele. 26a.7.1 Soluzioni contenenti 1000 mg/l

3 Per ogni composto in un matraccio tarato da 100 ml pesare mg di composto e portare a volume con acetonitrile. La soluzione se conservata in congelatore (-20 C) è stabile almeno per due mesi. 26a.7.2 Soluzione contenente 50 µg/ml di ogni analita (26a.6.13) In un matraccio da 100 ml si introducono 5 ml di ogni soluzione madre (26a, 7.1), e si porta a volume con acetonitrile. 26a.7.3 Soluzione contenente 10 µg/ml In un matraccio da 50 ml si introducono 10 ml della soluzione 26a.7.2 e si porta a volume con acetonitrile. 26a.7.4 Soluzione contenente 1 µg/ml In un matraccio da 50 ml si introduce 1 ml della soluzione 26a.7.2 e si porta a volume con acetonitrile. 26a.7.5 Soluzione contenente 0.1 µg/ml In un matraccio tarato da 100 ml si introduce 1 ml della soluzione 26a.7.3 e si porta a volume con acetonitrile. 26a.8 Procedimento 26a.8.1 Estrazione del campione In un flaconcino (26a.5.1) si pesa una quantità P (ca. 1 g) di fango e vi si introduce un'aliquota di sodio solfato (26a.6.7) sufficiente a disidratare il fango. Si aggiungono 0.2 g di sodio carbonato (26a.6.8) assicurandosi di essere in ambiente basico e 5 ml di cloroformio (26a.6.2). Si tappa il flacone e si estrae per 30 minuti in bagno a ultrasuoni (26a.5.6). La temperatura del bagno non deve superare i 30 C. Si lascia depositare e si separa la fase liquida. Si ripete l'estrazione altre due volte. Si riuniscono le tré frazioni si aggiungono 2 ml di alcol metilico (26a.6.3) e si concentra in evaporatore rotante (26a.5.7) fino ad 1 ml (Vf). 26a.8.2 Determinazione cromatografica L'estratto può venire utilizzato previa diluizione 1:1 nella fase mobile di partenza. Si iniettano 20 µl, nello strumento (26a.5.3) già predisposto per l'analisi, come indicato in appendice 1, e si misura l'area dei picchi. L'identificazione delle Animine Aromatiche presenti nel campione si esegue in base al confronto dei tempi di ritenzione dei picchi incogniti con quelli degli standards di riferimento. L'analisi quantitativa si effettua con il metodo dello standard esterno mediante curva di taratura, una per ogni singolo composto, preparando le soluzioni standard e registrando le aree dei picchi. Anche lo standard viene iniettato previa diluizione 1:1 nella fase mobile di partenza. Si ricava una curva riportando in ascissa l'area dei picchi e in ordinata la quantità di analita corrispondente.

4 26a.9 Calcolo La concentrazione C, di ogni componente presente nel campione espressa in mg/kg, è data dalla relazione: Appendice 1 Condizioni strumentali indicative

5 Appendice 2 Cromatogamma tipico di animine aromatiche ottenuto con le sopraindicate condizioni strumentali.

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7 Appendice 3 Purificazione del campione Al campione estratto con cloroformio (26a.8.1) si aggiunge 1 ml di toluene (26a.6.4) e si concentra in evaporatore rotante a 1 ml. TUtti gli adsorbenti da usare nella purificazione allumina acida, sodio solfato e sodio carbonato (26a.6.9, 26a.6.7, 26a.6.8) vengono lavati con metilene cloruro (26a.6.6) ed asciugati in stufa a bassa temperatura. Sodio solfato e sodio carbonato vengono anidrificati successivamente a 220 C. L'allumina acida viene attivata a 220 C per 2 h e posta in essicatore sotto vuoto a raffreddare. In una beutina si disattivano 12 g di allumina in n-esano (26a<6.5) con 120 µl di acqua (tipo I) e si lascia riposare, chiusa ermeticamente, per 1 h. I solventi usati nella purificazione devono essere degasati in bagno ad ultrasuoni. La colonna (26a.5.8) contenente 10 ml di n-esano viene impaccata nel seguente ordine: 6 g di sodio solfato, 1.5 g di sodio carbonato e 12 g di allumina preparata precedentemente. Si esegue un lavaggio preliminare della colonna con 20 ml di n-esano senza far andare a secco gli adsorbenti. Il campione da purificare, portato a 1 ml in toluene, viene caricato in testa alla colonna. Si esegue un primo lavaggio con 30 ml di n-esano e un secondo con 30 ml di cloroformio. Si eluiscono le animine aromatiche con 45 ml di cloroformio contenente il 10% di metanolo e IVo di acido cloridrico 0.1 M. Si concentra questa frazione a 1 ml (Vf) in metanolo con evaporatore rotante. Il campione purificato viene diluito prima dell'analisi nella fase mobile (1:1). È importante che non vi sia del cloroformio residuo in quanto interferente nell'analisi. NOTA: Le rese di purificazione sono per tutti i composti superiori al 90%; la difenilammina non viene recuperata. Nel caso di analisi quantitative, sarà indispensabile valutare con delle prove la resa della procedura di purificazione.

8 Appendice 4 In alternativa può venire utilizzato un rivelatore UV a lunghezza d'onda fissa (245 nm) con le seguenti condizioni cromatografiche: Nota: AI termine dell'analisi sono necessari 10 minuti di equilibrio con gradiente A 33% e B 67%.