Rapporti ISTISAN 04/xxx Effetto salting out Consiste in una diminuzione della solubilità di una specie chimica conseguente alla presenza di un
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- Agnese Mariani
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1 Rapporti ISTISAN 04/xx DETERMINAZIONE DELL ACRILAMMIDE. METODO PER ESTRAZIONE LIQUIDO-LIQUIDO ED ANALISI MEDIANTE GASCROMATOGRAFIA CON RIVELAZIONE A CATTURA DI ELETTRONI (GC-ECD) 0. Generalità e definizioni L acrilammide (2,3-propenammide) è una ammide insatura impiegata come monomero nella produzione di polimeri e copolimeri idrosolubili quali flocculanti poliacrilammidici di uso limitato nel trattamento chimico-fisico di potabilizzazione dell acqua destinata al consumo umano. La presenza dell acrilammide in acqua trova giustificazione nella cessione, da parte del materiale polimerico a contatto con l acqua, del monomero residuo della lavorazione industriale. L acrilammide, dalle evidenze sperimentali fino ad oggi acquisite, è risultata essere un composto solido tossico, ed è stata inclusa dalla IARC nel Gruppo 2A in quanto considerata probabile cancerogeno per l uomo. La normativa nazionale vigente in attuazione della direttiva 98/83/CE relativa alla qualità delle acque destinate al consumo umano stabilisce per l acrilammide un valore di parametro pari a 0,10 µg/l. Il metodo proposto per la determinazione dell acrilammide (Metodo EPA 8032A, Dicembre 1996) con modifiche solo formali, prevede la preliminare estrazione liquido-liquido dell analita seguita da rivelazione mediante GC-ECD Definizioni Standard interno (internal standard) Lo standard interno è un composto che viene addizionato al campione, nel caso dell analisi diretta, o all estratto prima dell analisi strumentale. Lo standard interno deve possedere un comportamento cromatografico molto simile a quello dell analita da determinare, non deve essere interferito da alcuna specie chimica e deve essere rappresentato da una molecola, stabile nel tempo, con formula di struttura simile a quella dell analita o da un comportamento chimico-fisico simile. L impiego dello standard interno è utile ai fini dell analisi quantitativa in quanto elimina gli errori generati dalle fluttuazioni di volume subiti dalla soluzione in esame e dalla soluzione iniettata; esso consente di determinare il recupero analitico per un campione arricchito con l analita, da una retta di taratura ottenuta da soluzioni primarie di riferimento esprimendo il segnale y come rapporto Areaanalita/Area standard interno in funzione della concentrazione x dell analita,. Lo standard interno si differenzia dallo standard di processo (surrogate) per il fatto che quest ultimo si aggiunge al campione prima di essere processato, cioè prima di essere sottoposto al trattamento preliminare previsto dal metodo analitico Limite di Rivelabilità del Metodo Il Limite di Rivelabilità del Metodo è la più bassa concentrazione di analita, in un campione processato, che produce un segnale che un Metodo è in grado di rivelare e di distinguere da un segnale del Bianco con una certezza statistica pari al 99%, cioè con una probabilità di commettere un falso negativo o Errore del Tipo II o Errore β pari all 1%. Il Limite di Rivelabilità del Metodo, è una caratteristica di prestazione di un metodo analitico la cui conoscenza consente soltanto di stabilire se un analita è presente o non rivelabile in un certo campione. 1
2 Rapporti ISTISAN 04/xxx Effetto salting out Consiste in una diminuzione della solubilità di una specie chimica conseguente alla presenza di un sale in elevata concentrazione Limite di quantificazione (o di determinazione) È la più bassa concentrazione di analita caratterizzata da valori accettabili di esattezza e di precisione. Al di sotto di tale limite i valori di esattezza e di precisione associati al risultato quantitativo della prova non sono noti in quanto non accettabili Intervallo lineare della curva di calibrazione È un insieme di valori di concentrazione nel quale la curva di calibrazione risulta lineare Soluzioni primarie di riferimento Sono soluzioni ottenute solubilizzando in un determinato volume di un adatto solvente una quantità esattamente pesata di un materiale di riferimento (analita, standard interno, standard di processo), ad elevato grado di purezza e preferibilmente certificato o comunque garantito. Possono essere reperibili in commercio in concentrazione nota o si possono preparare direttamente in laboratorio. Le soluzioni primarie di riferimento sono molto concentrate e conseguentemente risultano stabili anche per molti mesi, a condizione che siano conservate al buio, a basse temperature e in appropriati contenitori di vetro muniti di tappo a tenuta perfetta Abbreviazioni e acronimi IARC International Agency for Research On Cancer EPA Environmental Protection Agency GC-ECD gascromatografia con rivelatore a cattura di elettroni Mesh indica il numero di maglie (mesh) per pollice al quadrato di un setaccio attraverso il quale passa il supporto FFAP free fatty-acid phase 0.3. Misure di sicurezza La manipolazione, da parte dell analista, dell acrilammide riconosciuta quale probabile cancerogeno per l uomo insieme ad altri effetti tossici, richiede l adozione di un equipaggiamento protettivo idoneo a prevenire il contatto di questa molecola con la cute e la predisposizione di un sistema di aspirazione durante le operazioni analitiche per evitare l inalazione della molecola stessa. Analoghe cautele devono essere adottate anche per il benzene in virtù della sua accertata cancerogenicità per l uomo. La possibilità di formare una miscela esplosiva con l aria da parte delle particelle di acrilammide finemente disperse ne impone la conservazione in un locale isolato, fresco e bene aerato e la custodia lontano da sostanze ossidanti. 1. Campo di applicazione e principio del metodo 1.1. Campo di applicazione La procedura riportata consente di determinare l acrilammide in matrici acquose e di natura diversa ed è caratterizzata da un limite di rivelabilità pari a 0,032 µg/l. 2
3 Rapporti ISTISAN 04/xx 1.2. Principio del metodo Con il metodo descritto, il campione di acqua di volume non superiore a 50 ml viene inizialmente sottoposto alla reazione di bromurazione con formazione del corrispondente dibromo derivato - la 2,3- dibromopropionammide - seguita da estrazione con acetato di etile esaltata dall effetto di salting out ; l estratto viene eventualmente purificato su colonna di Florisil ed analizzato mediante gascromatografia con rivelazione a cattura di elettroni. L identificazione della acrilammide il campione deve essere confermata dall analisi su una seconda colonna gascromatografica con polarità diversa o mediante un gascromatografo accoppiato ad uno spettrometro di massa. 3. Interferenze e cause di errore Non sono state evidenziate sostanze interferenti nell acqua di mare e in presenza di ioni ammonio in concentrazione pari all 8%; eventuali impurezze derivanti dal bromuro di potassio vengono rimosse con la procedura di purificazione su colonna di Florisil (8.3.). 4. Campionamento e conservazione dei campioni Il campionamento deve essere eseguito sulla base di una idonea procedura. Per indicazioni specifiche in merito a tale aspetto si rimanda alle norme ISO , ISO , ISO e ISO Apparecchiatura 5.1. Attrezzatura comune di laboratorio Tutta la vetreria e i contenitori, prima del loro uso, devono essere accuratamente lavati con detergenti per vetreria e risciacquati in successione con acqua di rubinetto, acqua bidistillata e acetone, allo scopo di allontanare i possibili interferenti che potrebbero alterare il risultato analitico Imbuto separatore In vetro da 150 ml Matracci tarati In vetro di classe A, da 150 ml e in vetro scuro da 25 ml, muniti di tappo a smeriglio Microsiringhe Da 5 µl e 10 µl Pipette In vetro di classe A. 3
4 Rapporti ISTISAN 04/xxx Carta di alluminio 5.2. Colonna cromatografica In vetro, di lunghezza 30 cm e diametro interno 2 cm 5.3. Agitatore magnetico 5.4. Strumentazione analitica ed accessori Gas cromatografo con rivelatore selettivo a cattura di elettroni (GC-ECD) Il sistema è costituito, in sequenza, da: - dispositivo per l iniezione in colonna (iniettore), utilizzando microsiringhe come riportato in (5.4.) - colonna gascromatografica in vetro, lunghezza 2 m, diametro interno 3 mm, fase stazionaria FFAP al 5 % su supporto Chromosorb W (60-80 mesh) lavato con acidi, o altra equivalente rivelatore a cattura di elettroni Operazioni preliminari per l analisi GC-ECD - Attivare gascromatografo e rivelatore a cattura di elettroni predisponendoli al funzionamento secondo le specifiche indicate dal produttore. Dopo ripetute operazioni di condizionamento, sotto flusso di gas di trasporto, della colonna impaccata scollegata all uscita dal rivelatore, - fissare orientativamente ai fini della separazione le seguenti condizioni operative: - temperatura dell iniettore, 180 C - temperatura della colonna, isoterma a 165 C - flusso del gas di trasporto e dell eventuale gas ausiliario (make up) - temperatura del rivelatore, 185 C - volume idoneo di analita da iniettare in colonna - gas di trasporto, azoto, ulteriormente purificato on line mediante setacci molecolari o con altro sistema equivalente 6. Reagenti I solventi ed i reagenti devono possedere un grado di purezza idoneo per l analisi dei residui o comunque equivalente Acqua reagente Per la preparazione delle soluzioni di riferimento ( , ), delle soluzioni di taratura (7.1.1.) e per il risciacquo finale della vetreria deve essere usata acqua bidistillata o acqua di purezza equivalente e comunque esente da impurezze organiche che potrebbero interferire e quindi alterare il risultato analitico finale Solventi Preparazione dei solventi e degli standard Tutti i solventi devono essere di grado analitico e possedere requisiti speciali che li rendano idonei all impiego in gascromatografia. 4
5 Rapporti ISTISAN 04/xx Acetato di etile Acetone Benzene Dietiletere esente da perossidi Addizionato dopo la purificazione con 20 ml/l di etanolo per la conservazione Metanolo Acido bromidrico concentrato Di peso specifico pari a 1, Bromuro di potassio Idoneo per l analisi all infrarosso Florisil Polvere a 60/100 mesh, mantenuto in termostato a 130 C o preparato all occorrenza per attivazione a 130 C per 16 h e conservato in essiccatore fino al momento dell uso Soluzione satura di acqua di bromo Preparata agitando acqua esente da impurezze organiche (6.1.) con bromo e mantenendo la soluzione a riposo e a riparo della luce per 1 h a 4 C Solfato di sodio anidro Preferibilmente granulare e purificato per riscaldamento a 400 C per 4 h; in alternativa purificare con cloruro di metilene e accertare l assenza di contaminanti analizzando un bianco Tiosolfato di sodio In soluzione acquosa 1 M Colonna per la purificazione su Florisil Sospendere 5 g di Florisil attivato (6.2.8.) in benzene in colonna in vetro (5.7.) Soluzione primaria di riferimento di acrilammide Questa soluzione può essere reperibile in commercio in concentrazione certificata oppure può essere preparata in un matraccio tarato da 100 ml, solubilizzando circa 100 milligrammi esattamente pesati, di acrilammide (grado di purezza minimo pari al 95 %), e portando a volume con acqua reagente (6.1.) Soluzione primaria di riferimento di standard interno dimetilftalato Solubilizzare in etile acetato una quantità di dimetilftalato ((grado di purezza minimo pari al 99 %), tale da realizzare una concentrazione pari a 100 mg/l. 5
6 Rapporti ISTISAN 04/xxx Soluzioni secondarie di riferimento di acrilammide Vengono preparate, per opportune diluizioni con acqua reagente della soluzione primaria di riferimento ( ), a livelli di concentrazione indicativamente compresi tra 0,1 mg/l e 5 mg/l Taratura Requisiti generali Iniettare gli estratti ottenuti da cinque soluzioni di taratura processate partendo da volumi uguali al volume di campione. Il valore misurato di concentrazione dell analita nel campione, replicato per almeno tre volte, deve sempre cadere all interno dell intervallo lineare della curva di taratura (orientativamente compreso tra 0 e 5 µg/l) o essere riportato in esso per opportuna diluizione del campione. Inoltre, data la variabilità conseguente alla dipendenza dalle condizioni gascromatografiche, verificare periodicamente nel tempo la validità dell equazione corrispondente alla retta di taratura, ricavata con il metodo dei minimi quadrati, processando ed analizzando due soluzioni di taratura a diversi livelli di concentrazione Soluzioni di taratura Sono soluzioni contenenti acrilammide in acqua reagente (6.1.), ad almeno cinque diversi ma equamente spaziati livelli di concentrazione, che vengono processate in maniera analoga al campione (8.1., 8.2., 8.3.); ognuno dei cinque estratti ottenuti, prima dell analisi GC-ECD, deve essere arricchito con una quantità (100 microgrammi) di standard interno dimetilftalato identica a quella aggiunta all estratto ottenuto dal campione processato (8.2.7.). Vengono preparate di recente diluendo opportunamente le soluzioni secondarie di riferimento ( ) con acqua reagente in maniera da ottenere un volume di 50 ml. Il primo livello di concentrazione deve risultare molto prossimo al limite di rivelabilità del metodo (0,032 µg/l) mentre le altre quattro soluzioni devono possedere concentrazioni comprese nell intervallo di linearità (7.1.) della retta di taratura Controllo del bianco Prima di processare il campione, controllare almeno una aliquota di acqua reagente (6.1.) pari a 50 ml sottoponendola alla stessa procedura analitica per il campione, allo scopo di individuare gli eventuali interferenti presenti nel tracciato cromatografico al tempo di ritenzione dell acrilammide e dello standard interno usato e rimuovere la causa della contaminazione. 7. Procedura di misura La manipolazione del campione e in particolare la tecnica di separazione gascromatografica, prevista dal metodo, richiedono l impiego di personale specializzato Bromurazione - Pipettare 50 ml di campione di acqua in un matraccio di vetro tarato da 100 ml (5.3. ) munito di tappo a smeriglio - Disciogliere per agitazione 7,5 g di bromuro di potassio (6.2.7.) - Portare il ph della soluzione ad un valore compreso tra 1 e 3 con acido bromidrico (6.2.6) - Aggiungere 2,5 ml di soluzione satura di acqua di bromo (6.2.9.) e mantenere il matraccio avvolto in foglio di alluminio a 0 C per 1 h. - A reazione avvenuta, eliminare l eccesso di bromo aggiungendo goccia a goccia una soluzione 1 M di tiosolfato di sodio ( ) fino a completo scolorimento della soluzione in esame 6
7 Rapporti ISTISAN 04/xx - Aggiungere 15 g di solfato di sodio ( ) agitando vigorosamente la soluzione con agitatore magnetico 7.2. Estrazione liquido-liquido - Trasferire la soluzione (8.1.6.) in un imbuto separatore da 150 ml (5.2.) - Lavare il matraccio in successione per tre volte con aliquote da 1 ml di acqua reagente esente da contaminanti organici (6.1.) e trasferire i lavaggi nell imbuto separatore - Estrarre la soluzione acquosa in successione per due volte con aliquote da 10 ml di acetato di etile (6.2.1.) dibattendo ogni volta per 2 minuti con un agitatore meccanico a 240 vibrazioni al minuto e separando le fasi - Aggiungere alla fase organica 1 g di solfato di sodio ( ) agitando vigorosamente - Trasferire la fase organica in un matraccio di vetro scuro (5.3.) da 25 ml - Lavare il solfato di sodio per due volte con aliquote da 1,5 ml di acetato di etile e trasferire i lavaggi alla fase organica (8.2.5.) - Aggiungere 1 ml (100 microgrammi di dimetilftalato) della soluzione primaria di riferimento di dimetilftalato ( ) e portare a volume (25 ml) con acetato di etile; la concentrazione di dimetilftalato risulta così pari a 4 mg/l - Iniettare, con microsiringa (5.4.), un volume idoneo della soluzione (8.2.7) nella colonna gascromatografica (5.9.1.) - Se nel tracciato cromatografico c è evidenza di sostanze interferenti procedere con la purificazione su Florisil (8.3.) 7.3. Purificazione su Florisil - Trasferire l estratto essiccato (8.2.5) in un pallone da vuoto con 15 ml di benzene - Concentrare la soluzione, sotto pressione ridotta a 70 C, al volume di circa 3 ml e aggiungere 50 ml di benzene - Sottoporre quindi la soluzione a cromatografia su colonna di Florisil ( ) e percolare ad un flusso costante di 3 ml/min - Eluire la colonna inizialmente con 50 ml di una miscela di dietiletere/benzene (1:4) ad un flusso costante di 5 ml/min e scartare completamente l eluato - Fluire quindi con 25 ml di una miscela di acetone/benzene (2:1) ad un flusso costante di 2 ml/min e scartare i primi 9 ml di questo secondo eluato - Raccogliere in un matraccio tarato di vetro scuro (5.3.) da 25 ml il volume residuo del secondo eluato - Aggiungere 1 ml (100 microgrammi di dimetilftalato) della soluzione primaria di riferimento di dimetilftalato ( ) e portare a volume (25 ml) - Iniettare, con una microsiringa (5.4.), un volume idoneo della soluzione (8.3.7) nella colonna gascromatografica ( 5.9.1) 7.4. Analisi GC-ECD Identificazione in GC-ECD Basare l identificazione dell analita sull utilizzo del tempo di ritenzione relativo. Identificare l analita per confronto, a parità di condizioni sperimentali, tra il suo tempo di ritenzione cromatografico relativo allo standard interno riferito al campione in esame e il suo tempo di ritenzione cromatografico relativo allo standard interno riferito all ultima soluzione di taratura (7.1.1.). Il tempo di ritenzione relativo dell analita nel campione deve corrispondere a quello dell analita nell ultima soluzione di taratura con una tolleranza massima di ± 0,5% (Decisione 2002/657/CE). Il campione si considera positivo o non conforme, quando venga rispettato lo stesso criterio per un altra colonna con polarità diversa che riduce il rischio dei falsi positivi. 7
8 Rapporti ISTISAN 04/xxx Analisi quantitativa in GC-ECD La curva di taratura serve per determinare la concentrazione di un analita in una serie di almeno tre replicati di campione processato al fine di ottenere un basso valore del limite di confidenza al 95% per il risultato finale. Analizzare le soluzioni di taratura (7.1.1.) processate, iniettando un volume idoneo e tabulare il valore del rapporto tra l area corrispondente al picco cromatografico dell acrilammide e l area corrispondente al picco cromatografico dello standard interno dimetilftalato (Acrilammide /dimetilftalato) in corrispondenza di ogni livello di concentrazione di acrilammide. Con l ausilio di un programma dedicato (o di idonee espressioni matematiche) individuare l intervallo lineare della curva di calibrazione, per es. con il metodo dei residui, e determinare per questo intervallo: l equazione della retta di calibrazione con il metodo dei minimi quadrati Y = ax + b dove Y = rapporto Area acrilammide / Area dimetilftalato X = concentrazione di acrilammide nell estratto espressa in µg/l a = coefficiente angolare, a valore noto b = intercetta sull asse delle Y, a valore noto Dedurre il valore incognito della concentrazione X della acrilammide nel campione, sostituendo il valore della Y (media di tre repliche), ottenuto sperimentalmente per il campione processato, nella equazione della retta di taratura Espressione dei risultati I risultati, espressi in microgrammi per litro (µg/l), vengono riportati con due cifre significative per concentrazioni 0,10 µg/l (per es. 0,54 µg/l e 1,8 µg/l) e con una cifra significativa per concentrazioni < 0,10 µg/l (per es. 0,08 µg/l). Prestazioni del metodo La conformità delle caratteristiche di prestazione del metodo (esattezza, precisione e limite di rivelabilità) ai valori di riferimento richiesti dalla normativa nazionale vigente sarà verificata dalla applicazione di un opportuno protocollo da parte di laboratori diversi. BIBLIOGRAFIA Monografie IARC 60 (1994) (p. 389) IARC. Supplemento 7 (1987) (p. 120) DECRETO LEGISLATIVO 2 febbraio 2001, n. 31. Attuazione della direttiva 98/83/CE relativa alla qualità delle acque destinate al consumo umano, successivamente modificato dal DECRETO LEGISLATIVO 2 febbraio 2002, n.27. METHOD 8032A 8
x (opzione preferibile) a quella dell analita ma differente soltanto per la marcatura in uno o più siti della molecola con lo stesso isotopo stabile.
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