Validazione di un metodo di analisi. Dott. Lorenzo Catani
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1 Validazione di un metodo di analisi Dott. Lorenzo Catani
2 Argomenti trattati Introduzione alla validazione dei metodi analitici Parametri che caratterizzano un metodo analitico esempio pratico
3 Validazione Validazione di un metodo analitico: Conferma attraverso l esame e l apporto di evidenza oggettiva che i requisiti particolari per l utilizzazione prevista siano soddisfatti
4 Quando validare un metodo? Quando un metodo è non normato sviluppato e/o progettato dal laboratorio normato ma utilizzato al di fuori del proprio scopo e campo di applicazione prefissato le più comiuni situazioni sperimentali che impongono la validazione sono le seguenti: un nuovo metodo è sviluppato per scopi particolari; un metodo analitico normato deve essere aggiornato, migliorato o esteso ad un nuovo problema analitico; il controllo di qualità evidenzia variazioni temporali dei parametri di qualità; un metodo stabilito deve essere usato in un diverso laboratorio, da un diverso analista, con diversa strumentazione; è necessario dimostrare l equivalenza del metodo in esame con un metodo standard.
5 Validazione Il laboratorio che utilizza un metodo deve avere la documentazione che dimostri l appropriata validazione del metodo stesso. È responsabilità dell utilizzatore assicurare che la validazione documentata sia sufficientemente completa
6 Validazione Non ci sono linee guida ufficiali per la sequenza degli esperimenti necessari per la validazione La sequenza ottimale può dipendere dal metodo stesso
7 Parametri che caratterizzano un metodo analitico Campo di misura Specificità-selettività analitica limite di rivelabilità e di quantificazione range dinamico e lineare accuratezza intesa come esattezza più precisione (quest ultima a sua volta distinta in ripetibilità, precisione intermedia e riproducibilità) incertezza di misurazione robustezza.
8 Campo di misura (validità) Intervallo tra il più alto e il più basso livello dell analita determinabili con precisione ed accuratezza applicando il metodo stesso Il campo di misura (validità) è espresso nella stessa unità di misura dell analita Dipende dallo scopo del metodo
9 Specificità-Selettività analitica Specificità: Si riferisce ad un metodo che produce una singola risposta Selettività: si riferisce ad un metodo che produce più risposte (metodo separativo) ABILITÀ DI MISURARE ACCURATAMENTE L ANALITA IN PRESENZA DI INTERFERENTI
10 Limite di rilevabilità È la più bassa concentrazione dell analita che può essere rilevata, ma non necessariamente determinata quantitativamente, nelle condizioni sperimentali del metodo LdR=3*Sb/S Sb = deviazione standard del valore del bianco (almeno 5 campioni) S =coefficiente angolare della curva di taratura per metodi cromatografici Sb = D/5 dove D = differenza tra il valore massimo ed il valore minimo del rumore di fondo
11 Limite di quantizzazione La Più bassa concentrazione analitica che può essere determinata quantitativamente con accettabile precisione ed esattezza nelle condizioni sperimentali del metodo LdQ = 10*Sb/S Sb = deviazione standard del valore del bianco (almeno 5 campioni) S =coefficiente angolare della curva di taratura per metodi cromatografici Sb = D/5 dove D = differenza tra il valore massimo ed il valore minimo del rumore di fondo
12 Linearità La linearità di un metodo analitico è la sua abilità di dare risultati che sono direttamente proporzionali alla concentrazione degli analiti nei campioni all interno di un determinato campo di validità la proporzionalità può essere raggiunta anche attraverso trasformazioni matematiche ben definite
13 Linearità Deve essere verificata attraverso il calcolo del coefficiente di correlazione della curva di taratura eseguita, quando possibile, con aggiunte standard alla matrice da analizzare. Curve di taratura su matrici diverse o in soluzioni standard (contenenti soltanto il solvente e l'analita) possono essere utilizzate previa specificazione delle motivazioni nel metodo di prova. Sono generalmente accettati coefficienti di correlazione (r secondo il metodo dei minimi quadrati) pari almeno a 0,99. Una non-linearità significativa dovrebbe essere corretta mediante l'utilizzo dì funzioni di taratura non lineari o eliminata restringendo l intervallo di concentrazioni in cui si opera.
14 Linearità Si deve effettuare almeno da 3 a 6 repliche di 4 o più concentrazioni Nella validazione del metodo devono essere riportati il coefficiente di correlazione, la pendenza, l intercetta e i residui, oltre ad un grafico dei dati sperimentali e della curva calcolata
15 Esattezza Grado di concordanza tra il valore medio ottenuto a partire da un grande insieme dì risultati di prova, e un valore dì riferimento accettato
16 Per la valutazione dell esattezza: Confronto con un metodo analitico di ordine metrologico superiore Analisi di idonei materiali di riferimento certificati a diversi livelli di concentrazione Confronto con i valori attesi in studi collaborativi (circuiti interlaboratorio) Analisi di idonei campioni costruiti aggiungendo alla matrice quantità certificate di analita (Spike) a diversi livelli di concentrazione
17 Ripetibilità concordanza tra risultati di prova indipendenti ottenutì con lo stesso metodo su materiali ídentici, nello stesso laboratorio, dallo stesso operatore, usando la stessa apparecchiatura e in intervalli di tempo brevi (stessa serie analitica)
18 Per valutare la ripetibilità si possono usare: Campioni reali Materiali di riferimento certificati nella stessa matrice Materiali di riferimento in matrice ottenuti per aggiunta alla matrice stessa di soluzioni della sostanza pura
19 Precisione intermedia Concordanza tra risultati di prova indipendenti ottenuti con lo stesso metodo su material identici, nello stesso laboratorio, dallo stesso operatore, usando la stessa apparecchiatura e in intervalli di tempo lunghi (diverse serie analitiche con possibilità di cambiamento del lotto dei reattivi e dei materiali di consumo).
20 Per valutare la Precisione intermedia si possono usare: Campioni reali Materiali di riferimento certificati nella stessa matrice Materiali di riferimento in matrice ottenuti per aggiunta alla matrice stessa di soluzioni della sostanza pura
21 Riproducibilità concordanza tra risultati di prova indipendenti ottenuti con lo stesso metodo su materiali identici, in laboratori diversi, da operatori diversi, usando apparecchiature diverse e in intervalli di tempo diversi
22 Incertezza di misura stima legata ad un risultato di prova che caratterizza l'escursione dei valori entro cui si suppone che cada il valore vero del misurando Ha le dimensioni di uno scarto tipo e si indica con U"
23 Per valutare l incertezza può essere riassunto nei seguenti punti: specificazione del misurando (eseguita nel metodo di prova) definizione della relazione che lo lega alle grandezze misurate nel metodo di prova (ad esempio modello matematico per la misura della concentrazione specificato nel metodo di prova)
24 identificazione dei fattori che possono contribuire all'incertezza di misura per ogni stadio del processo eseguito in laboratorio (indicati nel metodo di prova) raccolta dei dati relativi alle prestazioni del metodo (studi collaborativi, studi di validazione in laboratorio, circuiti inetrlaboratorio)
25 u (y) quantificazione dei vari contributi all'incertezza dai dati relativi alle prestazioni del metodo, esprimendole come varianze o scarti tipo (incertezze tipo): u(x i ) combinazione delle incertezze tipo per ottenere l'incertezza composta:
26 trasformazione dell'incertezza composta in incertezza estesa U(y) = K u c (y) moltiplicando per il fattore di copertura (K) In generale K=2.
27 Robustezza Insensibilità a piccole variazioni dei parametri sperimentali Variazioni deliberate % solventi organici ph temperatura Flusso
28 Esempio di validazione Come esempio si riporta la validazione della determinazione dei cloruri solubili negli aggregati per confezione di calcestruzzi in cui abbiamo avuto la necessità di adattare un metodo normato (secondo la norma UNI 8520) ad un metodo più veloce e preciso.
29 Il metodo normato, dopo l attacco della sostanza prevede la determinazione dei cloruri in acqua, dopo precipitazione con AgNO 3, con un metodo gravimetrico, pesando dopo essiccazione il precipitato, o volumetrico, riprendendo il precipitato e poi retrotitolando con NH 4 CNS l argento in eccesso. Questo procedimento è stato semplificato utilizzando la tecnica della cromatografia ionica.
30 Principio del metodo Il campione è sottoposto a una solubilizzazione degli ioni attraverso acqua calda, su questa soluzione vengono determinati, tramite cromatografia ionica, i cloruri.
31 Campo di misura Il campo di misura varia tra 0,002 % e 0,050 % in peso di cloruri che rappresenta il range 10 % % del limite della presenza di cloruri in inerti per la confezione di calcestruzzi.
32 Taratura Cromatografo Ionico Standard iniziale soluzione a 1000 ± 5 mg/l di cloruri Con micropipetta prelevati 100 µl, 250 µl, 400 µl, 500 µl e portati tutti a 100 ml con acqua deionizzata Ottenute le seguenti concentrazioni: 1,00/ 2,50/ 4,00/ 5,00 mg/l Sono state effettuate quattro repliche per ogni concentrazione
33 Retta di taratura retta di taratura cloruri conteggi d'area y = 1,07E+06x - 1,15E+04 R 2 = 9,98E ,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 concentrazione mg/l
34 Analisi dei residui
35 Limiti di quantizzazione e di rilevabilità LdR=0,01 mg/l LdQ = 0,05 mg/l
36 Incertezza Ora valutiamo l incertezza della misuraanalizzando i vari contributi all incertezza
37 Incertezza della taratura Incertezza della vetreria e della diluizione: Matraccio da 100 ml: 0,00058 Micropipetta: std 1,00 mg/l = 0,00141 std 2,50 mg/l = 0, std 4,00 mg/l = 0, std 5,00 mg/l = 0, Da cui : INC tot : 0,00185
38 Incertezza dovuta alla bilancia Dal certificato di taratura della bilancia, l incertezza determinata (per n = 10 misure com i.c. 95%) è 0,040 mg INC bil = mg INC/P(10 g) =
39 Incertezza ripetibilità Le prove sono state effettuate su un campione di inerte analizzandolo 5 volte ottenendo il seguente risultato: 0,0346 ± 0,00123 da cui INC=0,0158
40 Incertezza dovuta alla taratura lineare Un aliquota di campione analizzato secondo la procedura precedentemente descritta porta ad avere una incertezza, dovuta alla taratura strumentale di: INC=0,0103
41 Incertezza vetreria analisi Matraccio da 1000 ml INC=0,00058
42 Incertezza composta ed estesa INC glob = 0,0189 Quindi in termini percentuali l incertezza associata alla determinazione dei cloruri negli inerti è pari a 1,89 % del valore trovato nel caso precedente si può esprimere il risultato: Cloruri = 0,0346 ± K*
43 Accuratezza Sono state effettuate 3 serie di 5 misure in giorni diversi su un campione noto, si è ottenuto una media di 0,0345 ± 0,00121, il campione è dato 0,0352 ± 0,00100 per cui il dato sperimentale rientra nel range del dato sperimentale.
44 Conclusioni L esempio riportato mostra come l incertezza della misura può essere stimata considerando tutti gli stadi della procedura valutando i singoli contributi.
A cura di P.I. Antonio Caprai e-mail: caprai@iirg.pi.cnr.it tel. ++39 050 3152391
CONSIGLIO NAZIONALE DELLE RICERCHE ISTITUTO INTERNAZIONALE PER LE RICERCHE GEOTERMICHE 56127 PISA (Italy) Via G. Moruzzi, 1 - Tel. 0503152381 0503152383 0503152384 Fax 050312562322 05031562323 e-mail:
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