RISOLUZIONE ENO 8/2007 DOSAGGIO DEL LISOZIMA NEL VINO CON CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTA PRESTAZIONE

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Flaviano Cavalli
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1 RISOLUZION NO 8/2007 DOSAGGIO DL LISOZIMA NL VINO CON CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTA PRSTAZION L ASSMBLA GNRAL, Considerato l Articolo 2 paragrafo 2 iv dell accordo istitutivo dell Organizzazione Internazionale della Vigna e del Vino, Su proposta della Sottocommissione dei Metodi di Analisi e Valutazione del Vino, DCID di completare l Allegato A del Compendio dei Metodi Internazionali di Analisi del Vino e del Mosto con il seguente metodo di tipo IV: Titolo Dosaggio del lisozima nel vino con cromatografia liquida ad alta prestazione Tipo Metodo IV 1. Introduzione preferibile utilizzare un metodo analitico per il lisozima non basato sull attività enzimatica. 2. Campo d applicazione Tale metodo consente la quantificazione del lisozima (mg di proteina/l) presente in vini bianchi e rossi, indipendentemente dalla attività enzimatica (che potrebbe essere compromessa da parziale denaturazione o da fenomeni di complessazione e coprecipitazione) della matrice. 3. Definizione La cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC), presenta un approccio analitico basato sull interazione di tipo sterico, polare o di adsorbimento fra la fase stazionaria ed l analita, quindi non legato all effettiva attività enzimatica dimostrata dalla proteina. 4. Principio L analisi è condotta mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) abbinando un rivelatore spettrofotometrico ad un rivelatore spettrofluorimetrico. Il contenuto ignoto nel campione di vino è calcolato in base all area del picco cromatografico, utilizzando la metodologia dello standard esterno. 5. Reagenti 5.1. Solventi e soluzioni Acetonitrile (CH 3 CN) HPLC grade Acido trifluoroacetico (TFA) puro Federico CASTLLUCCI 1

2 Acqua deionizzata con analisi HPLC Soluzione modello: Acido tartarico 1g/L, Alcol etilico 10% v/v, aggiustato a ph 3.2 con tartrato di potassio neutro 5.2. luenti A: CH 3 CN 1%, TFA 0.2 %, H 2 O 98.8% B: CH 3 CN 70%, TFA 0.2 %, H 2 O 29.8% 5.3. Soluzioni di riferimento Da 1 a 250 mg/l di lisozima standard, disciolto in soluzione modello mediante agitazione continua per almeno 12 ore. 6. Attrezzatura 6.1. Apparecchio HPLC dotato di sistema di pompaggio eluenti idoneo ad effettuare un eluizione a gradiente 6.2. Alloggiamento colonna termostatato (forno) 6.3. Rivelatore spettrofotometrico accoppiato a rivelatore spettrofluorimetrico 6.4. Loop, 20 µl 6.5. Colonna polimerica in fase inversa con gruppo funzionale fenile (diametro dei pori=1000 Å, limite di esclusione = Da) Toso Bioscience TSK-gel Phenyl 5PW RP 7.5 cm x 4.6 mm ID, a titolo di esempio Precolonna dello stesso materiale della colonna, Toso Bioscience TSK-gel Phenyl 5PW RP Guardgel 1.5 cm x 3.2mm ID, a titolo di esempio 7. Preparazione del campione I campioni di vino sono acidificati con HCl (10 M) diluito con rapporto di 10:1 e filtrati mediante filtro di poliammide i cui pori hanno un diametro di 0.22 µm, dopo 5 minuti dall aggiunta. L analisi cromatografica è condotta immediatamente dopo la filtrazione. 8. Condizioni operative 8.1. Flusso eluente: 1mL/min 8.2. Temperatura di eluizione: 30 C 8.3. Rivelazione spettrofotometrica: 280 nm 8.4. Rivelazione spettrofluorimetrica: λ ex = 276 nm; λ em = 345 nm; Gain = Programma del gradiente di eluizione Federico CASTLLUCCI 2

3 Tempo Sol A% Sol B% gradiente (min) Tempo di ritenzione medio del lisozima: minuti 9. Calcolo Sono analizzate in triplo le soluzioni di riferimento contenenti le seguenti concentrazioni di lisozima: 1; 5; 10; 50; 100; 200; 250 mg/l. Per ciascun cromatogramma, le aree del picco corrispondente al lisozima sono riportate su un diagramma in funzione delle rispettive concentrazioni, allo scopo di ottenere le rette di regressione espresse dalla formula Y= ax+b. Il coefficiente di determinazione r 2 dovrà essere > Validazione del metodo Con l obiettivo di valutare l adeguatezza del metodo allo scopo previsto, è stato eseguito uno studio di validazione, prendendo in considerazione la linearità, i limiti di rilevabilità e di quantificazione, l accuratezza del metodo. Quest ultimo parametro è stato determinato mediante la definizione del livello di precisione e di esattezza del metodo. Range di linearità Pendenza della retta Coefficiente di determinazione (r 2 ) LR LQ Ripetibilità (n=5) RSD% Riproducibilità (n=5) RSD% Mod. 1 V.R. 2 V.B. 3 Mod. 1 UV FLD Tabella 1: dati relativi alla validazione del metodo. 1 Matrice modello; 2 Vino rosso; 3 Vino bianco Federico CASTLLUCCI 3

4 10.1. Linearità del metodo Sulla base dei risultati ottenuti dall analisi di regressione, il metodo è risultato nei range riportati nella tabella Limite di Rilevabilità e di Quantificazione Il limite di rilevabilità (LR) ed il limite di quantificazione (LQ), sono stati calcolati come il segnale equivalente a rispettivamente 3 e 10 volte il rumore di fondo cromatografico in condizioni di lavoro su matrice reale (tabella 1) Precisione del metodo I parametri presi in considerazione sono stati la ripetibilità e la riproducibilità. Nella tabella 1 sono riportati i valori di tali parametri (espressi come St.dv.% di misure ripetute a diverse concentrazioni) riscontrati su matrice modello, su vino bianco e su vino rosso sattezza del metodo stato calcolato il recupero percentuale sulle soluzioni modello contenenti 5 e 50 mg/l di lisozima, aggiunte di quantità note di lisozima, come indicato nella tabella seguente. [C] iniziale nominale Aggiunta [C] teorica [C] trovata Dev. Std Recupero % UV 280 nm FD UV 280 nm FD Federico CASTLLUCCI 4

5 Fig.1 Cromatogrammi di vino rosso aggiunto di lisozima puro (una soluzione modello contenente 1000 mg/l di lisozima è stata aggiunta al vino per ottenere una concentrazione finale di 125 mg/l di lisozima). A: rivelatore UV a 280 nm; B: rivelatore UV a 225 nm; C: rilevatore FLD (λ ex 276 nm; λ em 345 nm). 11. Bibliografia: Claudio Riponi; Nadia Natali; Fabio Chinnici. Quantitation of hen s egg white lysozyme in wines by an improved HPLC-FLD analytical method. Am. J. nol. Vit. in press. Federico CASTLLUCCI 5

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