9. CAMPIONAMENTO, CON COLONNE CAPILLARI CORTE, DA SOLUZIONI ACQUOSE DELLA TOSSINA TRICHOTHECENE (T2) ED ANALISI DIRETTA MEDIANTE GC-FID E GC-MS

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1 9. CAMPIONAMENTO, CON COLONNE CAPILLARI CORTE, DA SOLUZIONI ACQUOSE DELLA TOSSINA TRICHOTHECENE (T2) ED ANALISI DIRETTA MEDIANTE GC-FID E GC-MS 9.1 Introduzione Le micotossine Trichothecene sono un gruppo di metaboliti secondari prodotti da diverse specie di fungo Fusarium. La contaminazione fungale di alimenti è stata a lungo la causa dell intossicazione degli animali e dell uomo [1,2]. Di recente la tossina T2 (una micotossina Trichothecene) per la sua elevata tossicità è stata proposta anche come agente per la guerra chimica e biologica [3]. Attualmente la tossina T2 viene determinata, negli alimenti o nei mangimi animali, mediante TLC o GC-FID dopo estrazione con solvente e purificazione su colonna in fase solida (SPE) o con metodi immunologici [4-6]. In questo lavoro viene proposto un metodo analitico, sensibile e riproducibile, per campionare ed analizzare la tossina T2 in campioni acquosi. Per l analisi GC sono stati utilizzati due gas-cromatografi (DANI, Monza) accoppiati in parallelo (sistema tandem). Il metodo prevede l impiego di una colonna capillare corta [7-9] ricoperta di SE-54, chimicamente legata, attraverso la quale viene fatto fluire un volume noto di campione acquoso a temperatura ambiente ed a velocità costante. Il soluto adsorbito (tossina T2), sulla colonna trappola, è successivamente rifocalizzato ed analizzato collegando in serie la colonna analitica (25 m) alla colonna campionatrice (2 m) con un connettore. 67

2 9.2 Esperimento Apparecchiatura Per l analisi GC sono stati utilizzati due gas-cromatografi (DANI, Monza) accoppiati in parallelo (sistema tandem). Nel primo gas-cromatografo (mod. 3900) viene installata una colonna capillare corta (SE-54, 2 m x 300 µm d.i., d f = 1.2 µm) per la rifocalizzazione del soluto; l ingresso della colonna trappola viene inserito nell iniettore mentre l uscita della colonna è collegata in serie con un connettore all ingresso della colonna analitica (SE-54, 25 m x 300 µm d.i., d f = 1.2 µm) installata nel secondo gascromatografo (mod HT). L uscita della colonna analitica è inserita nel rivelatore (FID), che è collegato ad un integratore-registratore HP Materiali Acetonitrile e cloruro di sodio sono stati forniti dalla Carlo Erba Reagenti (Milano). La tossina T2 (standard di riferimento) è stata fornita dalla Sigma. Le colonne capillari in silice fusa sono della Chromopack. La soluzione standard di T2 è stata preparata in acetonitrile (100 µg ml -1 ) e da questa per diluizione sono state preparate le soluzioni acquose a concentrazione nota di T 2 impiegate nello studio seguente Campionamento Volumi noti, di acqua distillata, di fiume, di mare e piovana filtrate con un filtro da 0.2 µm, a cui era stata aggiunta una soluzione standard di tossina T2, sono stati fatti fluire attraverso la colonna capillare corta (2 m) a temperatura ambiente ed alla velocità di 1.2 cm s -1. Successivamente essa viene lavata con 1 ml di acqua distillata ed asciugata facendo fluire, per qualche minuto, N 2 gassoso (UPP). Il dispositivo utilizzato per il campionamento è raffigurato in Fig.9. 68

3 Fig.9 Schema del dispositivo utilizzato per il campionamento dei campioni acquosi Analisi GC-FID Rifocalizzazione La colonna campionatrice installata nel primo GC, collegata alla colonna capillare analitica, è sottoposta alla seguente rampa di temperatura: 50 C per 60 secondi, quindi si programma la temperatura a 10 C min -1 fino a 300 C (isoterma di 5 minuti). Il gas vettore è l idrogeno (UPP) ad una velocità lineare di 37 cm s -1. Analisi Al termine della fase di rifocalizzazione si introduce nel secondo GC la parte terminale della colonna trappola e la parte iniziale della colonna capillare analitica collegate in serie e che si trovano a temperatura ambiente. A questo punto la colonna analitica viene sottoposta alla seguente temperatura: 50 C (60 secondi) successivamente si raggiunge la temperatura finale di 300 C (isoterma di 5 minuti) con un programma di 10 C min -1. Temperatura del rivelatore 290 C, gas vettore idrogeno (UPP) ad una velocità lineare di 37 cm s -1. In Figura 10 è riportato lo schema del sistema tandem. 69

4 Fig.10 Schema del sistema tandem Conferma tramite GC-MS Un gas cromatografo equipaggiato con un rivelatore a selezione di massa (mod. 5970, HP) è stato usato per confermare la tossina T2. Una colonna capillare in silice fusa ( 25 m x 300 µm d.i., d f = 1.2 µm di SE-54) era installata nel GC-MS. In Figura 11 è riportato lo schema di collegamento tra la colonna capillare trappola e la colonna capillare analitica. Le condizioni operative erano uguali a quelle descritte per l analisi in GC-FID. Il gas vettore era elio (UPP) ad una velocità di 32 cm s -1, la temperatura del trasfer line era di 270 C e l analisi è condotta in modalità SIM (selected ion monitoring). Gli ioni selezionati avevano le seguenti masse: m/z = 121; m/z = 285 e m/z = Analisi quantitativa L analisi quantitativa della tossina T2 è stata eseguita nel modo seguente: si eseguono diverse analisi con il sistema tandem in funzione; l introduzione nell iniettore (T=290 C) della T2 nel primo GC avviene a spillo chiuso successivamente si programma la temperatura del sistema tandem come descritto nella fase di rifocalizzazione e di analisi. I risultati ottenuti sono confrontati con quelli avuti dopo il campionamento delle soluzioni acquose. 70

5 Fig.11 Schema del collegamento della colonna capillare trappola nel GC-MS Risultati e discussioni In Figura 12 è riportata la formula di struttura della tossina T2, mentre nella Figura 13 sono riportati i valori ottenuti campionando diversi volumi di acqua contenti la stessa quantità di tossina T2, riferiti alla stessa quantità analizzata in splittless, i risultati riportati dimostrano la elevata riproducibilità del sistema studiato, inoltre questi dati indicano che sono indipendente dal volume di campione acquoso. In Figura 14 e 15 sono stati riportati i risultati della tossina T2 al variare della velocità di campionamento ed anche in questo caso non si notano differenze significative dai risultati riportati. La Figura 16 (area del picco vs concentrazione, µg µl -1 ) si riferisce alla curva di taratura della tossina T2 analizzata in splittless, si può notare la linearità di risposta nell intervallo di concentrazione studiato. In Tabella V sono stati riportati i risultati dell analisi di alcuni campioni acquosi reali a cui sono state aggiunte quantità note di T2 e i limiti di rilevabilità determinati secondo la definizione di Knoll (10). In Figura 17 è 71

6 riportato il cromatogramma di un campione di acqua di mareanalizzato con il metodo proposto, mentre in Figura 18 è riportato l analisi GC-MS (S.I.M.) di un campione di acqua distillata addizionato con T2. Fig.12 Struttura della tiossina T2. LD 50 = 3 mg Kg -1 (maiale della Guinea via orale). velocità di campionamento 1,2 cm/s 25 Area x Volume di campionamento (ml) Fig.13 Volumi di soluzione acquosa campionati contenenti la stessa quantità di T2 (1 µg). 72

7 velocità di campionamento 2,4 cm/s 25 Area x Volume di campionamento (ml) Fig.14 Volumi di soluzione acquosa campionati contenenti la stessa quantità di T2 (1 µg). velocità di campionamento 3,6 cm/s 25 Area x Volume di campionamento (ml) Fig.15 Volumi di soluzione acquosa campionati contenenti la stessa quantità di T2 (1 µg). 73

8 curva di taratura Area x mg/ml T2 Fig.16 Curva di taratura ottenuta da soluzioni standard analizzata in splittless. Tabella V - Determinazione della tossina T2 in diversi campioni di acqua (velocità di campionamento 1.2 cm s -1 ). * Deviazione standard relativa di tre determinazioni. Acqua di fiume e piovana soluzione 12 g L -1 di NaCl. Campione (5 ml) T2 aggiunto µg T2 trovato µg T2 aggiunto µg T2 trovato µg Limite di rilevabilità (ppb) Ac. di mare *6.5% Ac. di fiume *5.8% Ac. piovana *6.0%. 74

9 Fig.17 Cromatogramma ottenuto, con il sistema tandem da un campione di acqua di mare addizionato con T2 (A). Fig.18 Analisi di un campione acquoso addizionato di T2 in GC-MS in Selected Ion Monitoring (S.I.M.). 75

10 Conclusioni I risultati ottenuti in questo studio dimostrano l applicabilità del metodo analitico sviluppato per determinare la tossina T2 in sistemi acquosi. Esso risulta sensibile, riproducibile e permette di campionare volumi elevati di campioni acquosi senza alterare significativamente il dato quantitativo. 76

11 Bibliografia [1] Uewno U. (Ed), Trichothecenes, chemical, biological and toxicological aspects, Kodansha Ltd., Tokyo and Elsevier, Amsterdam, 1983, pp [2] Sarvad M.E., Greenhalgh R., Apsimon J.W., in Studies in natural products chemistry, A. Ur-Rahman (Ed), Elsevier, Amsterdam, The Nederlands, Vol. 6, Part. D, 1990, pp [3] Haig A.M. Jr., Report to the Congress from the Segretary of State, Chemical Warfare in Southeast Asia and Afghanistan, (Washinton, USA) 1982 [4] Scott P.M., Lawrence W., Van Walbeeck W., Appl. Microbiol., 1970, 20, [5] Kienz C.E., Verweij A., J. Chromatogr., 1986, 355, [6] Pesitka J.J., Lee S.C., Lau H.P., Chu F.S., J. AOAC 1975, 58, 940A- 944A [7] Goretti G., Russo M.V., Veschetti E., J. H. Resol. Chrom. & Chrom. Comm., 1992, 15, [8] Gorett G., Russo M.V., Veschetti E., Chromatographia, 1993, 35, [9] Russo M.V., Goretti G., Veschetti E., Cutilli D., Chromatographia, 2001, 54, [10] Knoll J.E., J. Chromatogr. Sci., 1985, 23,