RISOLUZIONE OIV/ENO 382D/2010

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1 ISOLUZIONE OIV/ENO 382D/2010 AGGIONAMENTO DELLA ACCOLTA DEI METODI INTENAZIONALI DI ANALISI DELLE BEVANDE SPIITOSE DI OIGINE VITIVINICOLA - determinazione dei composti α- dicarbonilici delle bevande spiritose di origine vitivinicola mediante cromatografia in fase gassosa dopo derivazione con l 1,2-diaminobenzene L'ASSEMBLEA GENEALE VISTO l articolo 2 paragrafo 2b iv dell Accordo del 3 aprile 2001 che ha portato alla creazione dell Organizzazione Internazionale della Vigna e del Vino, VISTE le azioni del Piano Strategico dell OIV , in particolare quella volta alla riorganizzazione delle pubblicazioni relative ai metodi di analisi vitivinicola, CONSIDEANDO i lavori della Sotto-Commissione dei Metodi di Analisi VISTA la accolta dei metodi internazionali di analisi delle bevande spiritose di origine vitivinicola adottata nel 2009 DECIDE di introdurre questo metodo nella «accolta dei metodi internazionali di analisi delle bevande spiritose d origine vitivinicola» 1/7

2 DETEMINAZIONE DEI COMPOSTI α-dicabonilici DELLE BEVANDE SPIITOSE DI OIGINE VITIVINICOLA MEDIANTE COMATOGAFIA IN FASE GASSOSA DOPO DEIVAZIONE CON L 1,2-DIAMINOBENZENE Metodo di tipo IV 1. Introduzione I principali composti α-dicarbonilici delle acqueviti di vino (Figura 1) sono: gliossale, metilgliossale, diacetile e pentano-2,3-dione. Gliossale: OCH CHO (etandiale) Metilgliossale: CH 3 CO CHO (2-ossopropanale) Diacetile: CH 3 CO CO CH 3 (butano-2,3-dione) Pentano-2,3-dione: CH 3 CH 2 CO CO CH 3 Esano-2,3-dione: CH 3 CH 2 CH 2 CO CO CH 3 Figura 1. I principali composti α-dicarbonilici del vino, (l esano-2,3-dione non è presente naturalmente nel vino ma è utilizzato come standard interno). I composti dicarbonilici sono importanti per via del loro impatto sensoriale. 2. Campo d applicazione Questo metodo si applica alle bevande alcoliche di origine vitivincola per tenori in composti carbonilici compresi tra 0,05 mg/l e 20 mg/l.. 3. Principio Il metodo è basato sulla formazione di derivati di tipo chinossalina a partire dai composti α- dicarbonilici con il 1,2-Diaminobenzene (figura 2). NH 2 O C + NH 2 O C 1,2-Diaminobenzene Dicarbonile Chinossalina Figura 2. Formazione dei derivati. N N La reazione avviene nella bevanda spiritosa diluita di un quarto, portata a ph 8 e dopo una reazione di 3h a 60 C. L analisi dei derivati è poi eseguita dopo l estrazione di derivati con il diclorometano e analisi con cromatografia in fase gassosa con una rilevazione mediante spettrometria di massa (GC-MS) o con l aiuto di un rilevatore specifico dei componenti azotati. 2/7

3 4. eagenti e prodotti 4.1 Composti dicarbonilici Gliossale (n. CAS ) in soluzione al 40 % Metilgliossale (n. CAS ) in soluzione al 40 % Diacetile (n. CAS ) di purezza > 99 % Pentano-2,3-dione (n. CAS ) di purezza > 97 % Esano-2,3-dione (n. CAS ) di purezza > 90 % 4.2 1,2-Diaminobenzene (n. CAS ) in polvere, di purezza > 97 % 4.3 Acqua per HPLC (secondo la norma EN ISO 3696) 4.4 Etanolo (n. CAS ) puro per HPLC 4.5 Idrossido di sodio (n. CAS ) 0,1 M. 4.6 Acido solforico (n. CAS ) 0,2 M 4.7 Diclorometano (n. CAS ) 4. 8 Solfato di sodio anidro (n. CAS ) 4.9 Soluzione idroalcolica al 50% vol. Mescolare 50 ml di etanolo puro per HPLC (4.4) con 50 ml d acqua (4.3) 4.10 Soluzione di standard interno esano-2,3-dione 2,0 g/1 Mettere 40 mg di esano-2,3-dione (4.2) in un flacone di 30 ml, diluire in 20 ml di soluzione idroalcolica al 50% vol (4.8) e agitare fino a completo scioglimento. 5. Apparecchiatura 5.1 Cromatografo in fase gassosa con rilevazione tramite spettrometria di massa (GC-MS) con l aiuto di un rilevatore specifico dei componenti azotati Colonna analitica capillare polietilene glicole mediamente polare (C 20M, BP21 ) con le seguenti caratteristiche (a titolo di esempio) 50 m x 0,32 mm x 0,25 µm Sistema di acquisizione dati 5.2 Apparecchio per la misurazione del ph 5.3 Agitatore magnetico 5.4 Bilancia di precisione da 0,1 mg. 5.5 Forno regolabile a 60 C 5.6 Usuale vetreria di laboratorio, come pipette, flaconi a vite da 30 ml e microsiringhe 6. Preparazione del campione Diluire la bevanda spiritosa a un quarto in acqua (4.3) 7. Modo operativo Mettere 10 ml di bevanda spiritosa diluita a un quarto (6) in un flacone da 30 ml (5.6) Portare a ph 8 agitando, con idrossido di sodio 0,1 M (4.5) Aggiungere 5 mg di 1,2-diaminobenzene (4.2) Aggiungere 10 µl di esano-2,3-dione (campione interno) 2,0 g/1 (4.10). Chiudere il flacone con un tappo a vite munito di setto con superficie teflonata Agitare fino alla scomparsa completa del reagente (5.3) Mettere in stufa a 60 C per 3 h (5.5) affreddare. 3/7

4 7.1 Analisi Estrazione delle chinossaline - Il mezzo di reazione preparato (7) è portato a ph 2 con l aiuto di H 2 SO 4 2M (4.6) ; - Estrarre a 2 riprese con 5 ml di diclorometano (4.7) e agitazione magnetica per 5 minuti; - Decantare la fase inferiore a ogni ripresa; - Miscelare le due fasi di solvente; - Fare sciugare su 1 g circa di solfato di sodio anidro (4.8) ; - Decantare Analisi cromatografica (fornita a titolo di esempio) - ilevazione. Per l analisi tramite GC-MS, un cromatografo in fase gassosa Hewlett Packard HP 5890 è stato accoppiato ad una chemstation e ad uno spettrometro di massa HP 5970 (impatto elettronico 70eV, 2,7 kv), Nota: Si può utilizzare un rilevatore specifico dei composti azotati - Colonna. La colonna è una BP21 (SGE, 50 m x 0,32 mm x 0,25 µm). - Temperature. Le temperature dell iniettore e del rilevatore sono rispettivamente di 250 C e 280 C; quella del forno è mantenuta a 60 C per 1 min, poi programmata con incremento di 2 C/min fino a 220 C e l isoterma finale dura 20 min. - Iniezione. Il volume iniettato è di 2 µl e il tempo di chiusura delle valvole dell iniettore (splitless) è di 30 s Analisi delle chinossaline formate - Separazione. Nella figura 3 è raffigurato il cromatogramma dei derivati tramite 1,2- diaminobenzene di una bevanda spiritosa secondo il metodo di selezione degli ioni (SIM). - Identificazione dei picchi. L utilizzo della GC-MS ha permesso di identificare i composti dicarbonilici derivati da un acquavite di vino utilizzando il metodo della corrente ionica totale (scan) che permette di ottenere gli spettri di massa dei derivati chinossalinici e di confrontarli con quelli in memoria nella biblioteca degli spettri; d altra parte i tempi di ritenzione sono stati confrontati con quelli dei composti puri trattati allo stesso modo. La tabella 1 mostra gli ioni principali degli spettri di massa dei composti dicarbonilici derivati ottenuti. - Dosaggio. La determinazione quantitativa dei composti dicarbonilici si esegue con il metodo SIM, selezionando ioni M / Z = 76, 77, 103, 117, 130, 144, 158 e 171. Gli ioni M/Z = 76 e 77 sono utilizzati per la quantificazione e gli altri come qualificatori, vale a dire gliossale: ioni M/Z =103 e 130, metilgliossale: ioni M/Z =117 e 144, diacetile: ioni M/Z = 117 e 158, pentano-2,3-dione: ioni M/Z = 171 e esano-2,3-dione: ioni M/Z = 158 e Caratteristiche del metodo Alcuni elementi di validazione interna sono stati determinati, ma non si tratta di una validazioneformale secondo il protocollo per la pianificazione, lo svolgimento e l interpretazione degli studi relativi alle prestazioni dei metodi di analisi (OIV 6/2000) - ipetibilità. La ripetibilità del metodo tramite GC-MS-SIM. mostra coefficienti di variazione compresi tra 2 e 5% per i quattro composti dicarbonilici; 4/7

5 - Tasso di ricupero. Le quantità aggiunte a un vino sono state recuperate con uno scarto inferiore al 6% rispetto al valore atteso; - Linearità. Sono state ottenute correlazioni lineari in intervalli di concentrazione compresi tra 0,05 e 20 mg/l. - Limite di rilevazione. Il limite di rilevazione della maggior parte dei prodotti dicarbonilici derivati è di 0,05 mg/l. Tabella 1. Spettri di massa (ione m/z (intensità dello ione molecolare relativa a quella del picco di base) dei derivati tramite l 1,2-diaminobenzene dei composti dicarbonilici. Composti dicarbonilici Derivato Spettro di massa (principali ioni e abbondanza) Gliossale Chinossalina 130 (100), 103 (56.2), 76 (46.8), 50 (20.2), 75 (10.4), 131 (9.4) Metilgliossale 2-Metilchinossalina 144 (100), 117 (77.8), 76 (40.5), 77 (23.3),50 (21.9), 75 (11.3), 145 (10.3) Diacetile 2,3-Dimetilchinossalina 117 (100), 158 (75.6), 76 (32.3), 77 (23.1), 50 (18.3), 75 (10.4) Pentano-2,3-dione 2-Etil-3-metilchinossalina 171 (100), 172 (98), 130 (34.1), 75 (33.3), 77 (21), 50 (19.4), 144 (19), 143 (14.1), 103 (14) Esano-2,3-dione 2,3-Dietilchinossalina 158 (100), 171 (20.1), 76 (13.7), 77 (12.8), 159 (11.4), 157 (10.8), 50 (8.1) 106 5/7

6 Abundance Colonne polaire Time--> Figura 3. Cromatogramma in fase gassosa dell estratto dei composti dicarbonilici derivati tramite il 1,2- diaminobenzene di un acquavite di vino, rilevati in spettrometria di massa scegliendo gli ioni m/z =76, 77, 103, 117, 130, 131, 144, 158, 160 e 171. Colonna BP21, 50m X 0,32mm 0,25 µm. Temperatura del forno 60 C per 1 min, poi programma con incremento di 2 C/min fino a 220 C. Temperatura dell iniettore: 250 C. 1. Gliossale ; 2. metilgliossale ; 3. diacetile ; 4. pentano-2,3-dione ; 5. esano-2,3-dione (standard interno) ; 6. fenilgliossale (non dosato mediante tale metodo). 6/7

7 8. Bibliografia Bartowski E.J.and Henschke P.A. The buttery attribute of wine diacetyl desirability spoilage and beyond. Int. j.food microbial. 96 : (2004). Bednarski W, Jedrychowski L, Hammond E and Nikolov L, A method for determination of - dicarbonyl compounds. J Dairy Sci 72: (1989). Leppannen O, onkainen P, Koivisto T and Denslow J, A semiautomatic method for the gas chromatographic determination of vicinal diketones in alcoholic beverages. J Inst Brew 85: (1979). Martineau B, Acree TE and Henick-Kling T, Effect of wine type on the detection threshold for diacetyl. Food es Int 28: (1995). Moree-Testa P and Saint-Jalm Y, Determination of -dicarbonyl compounds in cigarette smoke. J Chromatogr 217: (1981). de evel G Pripis-Nicolau L. Barbe J.-C; and Bertrand A, The detection of α-dicarbonyl compounds in wine:by,formation of quinoxaline derivatives. J Sci. Food Agric.80: (2000). de evel G and Bertrand A, Dicarbonyl compounds and their reduction products in wine. Identi cation of wine aldehydes. Proc 7th Weurman Flavour esearch Symp, Zeist, June, pp (1994). de evel G and Bertrand A, A method for the detection of carbonyl compounds in wine: glyoxal and methylglyoxal. J Sci. Food Agric 61: (1993). Voulgaropoulos A, Soilis T and Andricopoulos N, Fluorimetric determination of diacetyl in wines after condensation with 3,4-diaminoanisole. Am J Enol Vitic 42:73-75 (1991). 7/7