5.1 SPETTROMETRIA DI MASSA
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- Arnaldo Casati
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1 5.1 SPETTROMETRIA DI MASSA La spettrometria di massa è una tecnica analitica che fornisce informazioni utili sulla struttura chimica dei composti esaminati, permettendone l identificazione e la determinazione quantitativa. Questa tecnica non si basa sulla rivelazione di segnali dovuti a variazioni energetiche che le sostanze subiscono durante il processo analitico (come in assorbimento o emissione) ma su segnali che derivano dai risultati di reazioni di ionizzazione e frammentazione di vario genere. La sostanza originaria infatti,viene prima vaporizzata e poi ionizzata; può subire inoltre delle frammentazioni trasformandosi in ioni aventi massa minore. Gli ioni e i frammenti ionici così ottenut, differiscono tra loro per i valori del rapporto m/z ( massa / carica ) e quindi diventano separabili per azione di campi elettrici e/o magnetici. Le abbondanze relative dei diversi frammenti, riportate su un diagramma in funzione dei rispettivi rapporti m/z forniscono quello che si dice uno spettro di massa. Poichè i diversi composti subiscono in genere delle frammentazioni che sono caratteristiche dei composti stessi in quanto legate alla loro natura chimica, essi possono essere riconosciuti esaminando i rispettivi spettri di massa. Al di là delle differenze strumentali e delle tecniche particolari adottate dai diversi costruttori, la sequenza operativa fondamentale necessaria per eseguire uno spettro di massa, prevede sempre le seguenti operazioni: vaporizzazione del campione a pressione ridotta ionizzazione frammentazione elaborazione del segnale e registrazione dello spettro di massa scansione e rivelazione dei frammenti separazione o analisi di massa ( differenti rapporti m/z) Cenni sulla strumentazione a. Ingresso dei campioni nello spettrometro I campioni introdotti devono essere vaporizzati; ciò comporta il fatto che anche composti solidi o liquidi che presentano tensioni di vapore molto basse, debbano essere comunque portati allo stato di vapore. Occorre pertanto che il sistema di introduzione dei campioni sia costituito da una camera di vaporizzazione a pressione ridotta ( mm/hg di pressione residua) che può essere riscaldata fino a I sistemi di introduzione del campione possono essere diversi a seconda che si tratti di gas, liquidi o solidi relativamente volatili o che si tratti invece di solidi o liquidi ad alto peso molecolare e quindi poco o affatto volatili. Nel primo caso il sistema di introduzione è discontinuo; il campione da esaminare viene messo in un tubicino staccabile, collegato alla linea di vuoto e vaporizza in seguito alla bassa pressione creata in un polmone mediante una pompa da vuoto che realizza un vuoto con pressione residua di mm/hg; tale polmone è situato in una camera termostatica riscaldata elettricamente (Fig. 1). 1
2 I campioni poco volatili o quelli termolabili vengono inseriti invece direttamente nella camera di ionizzazione. Essi vengono collocati in coppette metalliche inserite in blocchi riscaldanti, anch essi metallici portati elettricamente ad alta temperatura. L immissione dei vapori generatisi nella coppetta, all interno della camera di ionizzazione avviene attraverso un foro piccolissimo per aspirazione prodotta dal vuoto della camera. In ultima analisi se i composti da Fig. 1 analizzare dovessero risultare particolarmente poco volatili, possono essere preventivamente derivatizzati con le stesse tecniche di derivatizzazione dei composti, normalmente usate in GC per aumentarne la volatilità. b. Sorgente di ioni La sorgente di ioni è il sistema in grado di creare, a partire dalla molecola neutra di campione allo stato di vapore, ioni primari che poi subiscono delle frammentazioni trasformandosi in ioni aventi massa inferiore. L energia connessa ai diversi sistemi di ionizzazione è responsabile del numero, del tipo e dell abbondanza relativa dei vari frammenti che derivano dalla molecola in esame. Sistemi di ionizzazione più blandi comportano la formazione di un numero minore di ioni con conseguente ottenimento di spettri di massa meno complicati. Le frammentazioni avvengono in tempi molto brevi dell ordine di 1 µsec. Tra i sistemi di ionizzazione più usati si possono segnalare: ionizzazione per urto elettronico EI (electronic impact): questo sistema di ionizzazione si basa sugli urti che avvengono tra molecole del campione in entrata nella camera di ionizzazione, con elettroni emessi da un filamento di W portato all incandescenza ed accelerati da un campo elettrico (cannone elettronico). Questi elettroni aventi elevata energia, sono in grado di provocare la ionizzazione di quasi tutte le molecole organiche. Il campione si ionizza dando: MOL + e - MOL + + 2e - MOL = molecola dell analita MOL + = ione molecolare primario (parent ion) Lo ione primario MOL + può trovarsi, a seconda dell energia che ha ricevuto nell impatto con l elettrrone, in stati energetici diversi caratterizzati da diversi contenuti di energia interna (rotazionale, vibrazionale, elettronica). 2
3 Questi contenuti elevati di energia interna comportano delle frammentazioni successive dello ione primario verso forme a minore contenuto energetico: MOL 1 + MOL MOL + MOL Le frammentazioni possono avvenire in seguito a scissioni omolitiche o eterolitiche di legami cui possono seguire anche riarrangiamenti tra le particelle formatesi (ioni, radicali, ecc.) con formazione di ioni di diverso tipo. Altri ioni primari invece, che hanno minore contenuto di energia interna, rimangono stabili e non subiscono frammentazioni. Nello spettro di massa, perciò, comparirà un picco in corrispondenza della massa molecolare di MOL. La sorgente di ioni è completata poi da un cannone ionico, cioè da un sistema che accelera e indirizza gli ioni primari e i frammenti ionici, verso un altra zona dello strumento dove avviene l analisi di massa. Uno schema del processo di ionizzazione per urto elettronico è riportato in Fig. 2 Fig tubo a vuoto di ingresso del campione 2. filamento di W incandescente (sorgente di elettroni) 3. bersaglio del fascio di elettroni 4. camera di ionizzazione con "cannone elettronico" 5. "lenti" del "cannone ionico" 6. isolatori 7. fascio di ioni accelerati diretti all'analizzatore di massa 8. fascio di elettroni ionizzazione di tipo chimico CI (chemical ionisation): è un sistema di ionizzazione secondaria. In esso si producono prima degli ioni in una camera di ionizzazione primaria, facendo agire un sistema ad impatto elettronico EI su molecole gassose di metano, argon, ecc. Gli ioni prodotti in questa camera vengono accelerati e fatti urtare contro le molecole gassose del composto in esame. In tal modo queste ultime si ionizzano cedendo un elettrone. Come si può facilmente comprendere si tratta di sistemi di ionizzazione blandi in cui il picco più abbondante è quello relativo allo ione primario MOL + (parent ion). ionizzazione con atomi veloci FAB (fast atom bombardment): in questo caso si tratta di una sorgente di atomi neutri di un gas nobile (per esempio Ar) eccitati opportunamente, che vengono mandati a urtare contro le molecole gassose del campione. Con questa tecnica di ionizzazione si possono analizzare anche macromolecole, tensioattivi, polisaccaridi, ecc., cioè molecole ad elevato peso molecolare che presentano volatilità irrilevanti. 3
4 c. Analizzatori di massa La valutazione delle prestazioni di uno spettrometro di massa si fanno in base alle sue capacità di risoluzione R: m R = m dove m è la massa di un certo ione e m è la differenza minima di massa che deve esserci tra due ioni perchè le rispettive righe consecutive risultino separate. Gli apparati preposti alla separazione dei diversi ioni in base ai loro rapporti massa/carica si dicono analizzatori di massa. I più importanti di essi sono: analizzatori a campi elettromagnetici: sono gli analizzatori di massa più comuni. In essi gli ioni in uscita dal cannone ionico entrano in un tubo sotto vuoto (tubo di volo) che presenta un tratto centrale curvo. Quest ultimo si trova tra i poli di un elettromagnete che costringe gli ioni ad abbandonare il percorso rettilineo facendo curvare la loro traiettoria con raggi di curvatura diversi che dipendono dai rispettivi rapporti m/z. Gli ioni aventi massa minore, risultano più deviati. Uno schema di un analizzatore ad elettromagneti è riportato in Fig Ingresso della sorgente 2. Uscita al rivelatore 3. Poli dell'elettromagnete Fig. 3 - Particolare di un analizzatore elettromagnetico 4. Tubo di volo L energia cinetica degli ioni accelerati dal cannone ionico è data da: 1 2 mv = Vz 2 dove V è la tensione di accelerazione e z è la carica dello ione. Se H è l intensità del campo magnetico che produce la curvatura delle traiettorie si dimostra che: r = 2 V m z H Il raggio di curvatura del tubo di volo è costante e quindi perchè uno ione lo attraversi tutto e colpisca il rivelatore, deve avere una traiettoria con raggio di curvatura ben determinato. Quindi è possibile effettuare una scansione con rivelazione di tutti gli ioni presenti, facendo variare il valore dell intensità del campo magnetico e mantenendo costante la tensione di accelerazione V. 4
5 analizzatori di massa a tempo di volo TOF (time of flight): in questo tipo di analizzatori, i diversi ioni vengono diversificati in base ai tempi necessari ad ognuno di essi per percorrere il tubo di volo e giungere al rivelatore. I diversi ioni, in uscita dal cannone ionico hanno infatti, velocità diverse che dipendono dalle loro masse: Vz v = 2 m Il tubo di volo in questo caso è lineare ed ha una lunghezza maggiore. I tempi di percorrenza del tubo di volo da parte dei diversi ioni sono dati da: L t = v La tensione di accelerazione in questo tipo di analizzatori non è fornita con continuità ma a impulsi per evitare che dando ai diversi ioni un accelerazione continua, essi possano uscire quasi nello stesso tempo non riuscendo a separarsi. La miscela di ioni aventi masse diverse entra nel tubo di volo e qui gli ioni si distanziano tra loro: gli ioni aventi masse minori giungeranno prima al rivelatore. analizzatore di massa a quadrupolo: è l analizzatore più usato nei sistemi accoppiati GC-MS (gas massa); in esso si usano campi elettromagnetici non statici ma dinamici. Il quadrupolo è un sistema costituito da quattro barrette cilindriche (Fig. 4) collegate tra loro elettricamente a due a due. Gli ioni provenienti dal cannone ionico percorrono la parte centrale del quadrupolo lungo l asse longitudinale. Alcuni ioni hanno un percorso stabile di tipo Fig. 4 e arrivano fino al rivelatore mentre altri assumono un cammino instabile del tipo e cadono sulle barrette. Ai quattro poli si applicano una tensione continua e una a radiofrequenza; il cambio di polarità è sfasato di 180. Facendo variare i valori delle due tensioni applicate (la continua e quella a RF), i diversi ioni assumeranno in modo sequenziale il percorso stabile e arriveranno separati al rivelatore. analizzatore di masse a trappola ionica (ion trap): sono sistemi molto simili al quadrupolo capaci di intrappolare gli ioni al centro di un sistema di elettrodi di cui uno centrale ha una geometria particolare; ad esso è applicata una tensione a radiofrequenza. Facendo variare questa tensione, i diversi ioni vengono liberati selettivamente e si dirigono verso il rivelatore. 5
6 d. Rivelatore Il sistema di rivelazione negli spettrometri di massa, specie con modesti flussi di ioni, è costituito dai cosiddetti moltiplicatori elettronici che presentano un funzionamento analogo ai fotomoltiplicatori utilizzati nelle apparecchiature spettrofotometriche; la sola differenza consiste nel fatto che l emissione di elettroni secondari da parte del catodo non è prodotta da una radiazione luminosa ma da ioni Cenni di analisi qualitativa e quantitativa in MS a. Analisi qualitativa Utilizzando un sistema di ionizzazione più blando si ottiene una riga molto intensa costituita dallo ione primario MOL + (parent ion). Questa tecnica può quindi servire a conoscere il peso molecolare della sostanza in esame. Se si usa invece il sistema a impatto elettronico come sistema di ionizzazione, si ottengono molti frammenti dalle molecole ionizzate. L analisi qualitativa si basa sulla posizione delle righe sulla scala delle acisse (m/z) e sulla loro abbondanza relativa (vedi esempi di due spettri di massa del 2-propanolo). Per quanto riguarda il riconoscimento delle sostanze, questo si può effettuare basandosi sullo studio dei frammenti presenti nello spettro. Associando tali frammenti opportunamente si dovrebbe ottenere un composto, il cui peso molecolare dovrebbe corrispondere a quello del picco parent. Attualmente però, il riconoscimento di una sostanza si avvale del confronto automatico operato dal computer, tra lo spettro di massa della sostanza in esame e quelli di migliaia di spettri disponibili in un archivio di spettri. In uno dei sistemi di ricerca computerizzata, la library search, si realizza un confronto tra lo spettro della sostanza incognita e quelli in memoria; il computer individua tra i molti spettri archiviati quelli che presentano una somiglianza più spiccata con quello della sostanza in esame, ne fornisce un elenco e dà inoltre, per ognuno di essi, un diverso grado di probabilità che si tratti proprio della sostanza cercata. b. Analisi quantitativa Per l analisi quantitativa occorre anzitutto scegliere una delle righe presenti nello spettro. La scelta di tale riga va fatta tra quelle presentanti maggiore abbondanza relativa e che, ripetendo più volte lo spettro, appare sempre con la stessa intensità (riproducibilità della riga analitica). Per arrivare però alla concentrazione di una sostanza in esame, occorre però confrontare l altezza della riga analitica, caratteristica di quella particolare sostanza, con le altezze delle righe ottenute con soluzioni standard. Anche per questo tipo di spettrometria si possono costruire curve di taratura della sostanza in esame con più standard aventi diversa concentrazione. Questi metodi quantitativi forniscono ottimi risultati, anche a livello di tracce, a condizioni però che la riga analitica non sia sovrapposta a righe di frammenti derivanti da altre sostanze, aventi però lo stesso valore del rapporto m/z. 6
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