M/z: Nozioni di Spettrometria di Massa e di Proteomica Applicata alla Biomedicina

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1 Laboratorio Proteomica M/z: Nozioni di Spettrometria di Massa e di Proteomica Applicata alla Biomedicina Marco Gaspari

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3 Argomenti Nozioni di analisi proteomica Gel elettroforesi bidimensionale Elementi costitutivi dello spettrometro di massa Ionizzazione MALDI Ionizzazione ESI Analizzatore a tempo di volo Spettrometria di massa in tandem Identificazione di proteine tramite PMF o MS/MS Applicazioni cliniche

4 Analisi proteomica

5 Analisi proteomica

6 Gel elettroforesi 2D: prima dimensione Caricamento del campione Applicazione voltaggio - Isoelettrofocalizzazione (separazione in funzione del punto isoelettrico) Gradiente di ph pi = 4.2 pi = 5.2 pi = 6.8

7 Gel elettroforesi 2D: seconda dimensione Aggiunta SDS

8 Gel elettroforesi 2D: seconda dimensione - Campo elettrico SDS PAGE (separazione in funzione delle massa)

9 Analisi proteomica

10 Analisi proteomica Lista di proteine differenzialmente presenti nel tessuto tumorale

11 La spettrometria di massa e una sofisticata tecnica analitica in grado di: Determinare il peso molecolare di una grande varieta di molecole e biomolecole (peptidi, proteine) Fornire informazioni strutturali sulle proteine, e sulle loro modificazioni post-traduzionali. Effettuare analisi quantitativa sia di piccole molecole che di biomolecole, fornendo alta sensibilita ed elevata specificita

12 Spettrometria di massa Per effettuare un analisi mediante spettrometria di massa bisogna impartire una carica elettrica alla molecola di interesse, cioe l analita, e successivamente misurare come le traiettorie dello ione risultante rispondono nel vuoto a varie combinazioni di campi elettrici e magnetici. John Fenn, Premio Nobel per la Chimica 2002 Le traiettorie degli ioni dipendono dal loro rapporto massa/carica m/z

13 1D PAGE Spettro di massa 100 M 1 % Intensity M m/z

14 Componenti di uno spettrometro di massa Camera di ionizzazione MALDI, ESI Analizzatore Analizzatore a tempo di volo, quadrupolo Rivelatore Fotomoltiplicatore, elettromoltiplicatore

15 Componenti di uno spettrometro di massa Camera di ionizzazione MALDI, ESI Analizzatore Analizzatore a tempo di volo, quadrupolo Rivelatore Fotomoltiplicatore, elettromoltiplicatore

16 Ionizzazione Condizione necessaria all analisi spettrometrica e la generazione di specie cariche in fase gassosa. Tale processo e detto ionizzazione. Il processo richiede energia Costruito il primo spettrometro di massa 1907 EI CI FAB 1981 ESI MALDI

17 Tipi di ionizzazione (1) Protonazione M H à MH NH 3 Deprotonazione O M - H à [M-H ] - O -

18 Tipi di ionizzazione (2) Addizione cationica OH M Na à MNa Na OH Espulsione di elettroni. - e - M à M. CH 3

19 Principali tecniche di ionizzazione Ionizzazione hard EI (electron impact) Ionizzazioni soft MALDI (matrix-assisted laser desorption ionisation) ESI (electrospray ionisation)

20 MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation La tecnica e basata su un analisi in fase solida, anche se il campione di partenza e in genere in soluzione. L energia necessaria alla ionizzazione del campione e fornita sotto forma di radiazione elettromagnetica. La radiazione e inviata in pacchetti ad alta intensita tramite un impulso laser

21 MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation Matrice HO COOH COOH DHB OH H CHCA CN Campione (proteina,peptide, acido nucleico, zucchero) Laser ad azoto, emissione a 337 nm (UV)

22 MALDI- preparazione del campione Soluzione di matrice Soluzione campione Miscelare (la matrice e in forte eccesso) Depositare sulla piastra metallica (1 µl) Piastra metallica per la deposizione del campione e l analisi Piastra metallica Lasciare cristallizzare Piastra metallica

23 MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation 20 kv Impulso laser Piastra metallica All analizzatore Matrice Proteina

24 MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation Genera per lo piu specie monocarica Buona tolleranza a contaminanti e Sali Capace di ionizzare proteine (> 300 kda) % Intensity m/z

25 MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation Genera per lo piu specie monocariche Buona tolleranza a contaminanti e Sali Capace di ionizzare proteine (> 300 kda) 100 % Intensity [M2H] [MH] m/z

26 Elettrospray - ESI La tecnica e basata sulla nebulizzazione di una soluzione contenente il campione da analizzare. L energia di ionizzazione e fornita da un campo elettrico generato tra l ago di introduzione del campione e lo spettrometro di massa.

27 Elettrospray - ESI Campo elettrico sufficiente Ionizzazione Polo positivo Polo negativo V 50 V MS inlet - Alimentatore

28 L elettrospray genera ioni multicarica Goccia generata da elettrospray La goccia evapora lungo il tragitto che porta allo spettrometro La proteina ionizzata entra nello spettrometro di massa La ionizzazione mediante elettrospray di una soluzione contenente una singola proteina generera un segnale multiplo allo spettrometro di massa, dovuto al fenomeno della formazione di ioni multicarica.

29 MALDI & ESI: interleuchina % Intensity Mw=20899 MALDI % intensity m/z Mw=20904 ESI m/z

30 Componenti di uno spettrometro di massa Camera di ionizzazione MALDI, ESI Analizzatore L analizzatore svolge il compito di separare gli ioni secondo il loro rapporto m/z prima che essi arrivino al rivelatore Rivelatore Fotomoltiplicatore, elettromoltiplicatore

31 Analizzatore a tempo di volo Ionizzazione E k = ½ mv 2 Campione Pusher, kv Rivelatore Campo elettrico Assenza di campo elettrico

32 Analizzatore a tempo di volo In un analizzatore a tempo di volo (TOF), gli ioni vengono separati all interno di uno spazio di 1-2 metri compreso tra la sorgente di ionizzazione ed il rivelatore, detto tubo di volo. Ioni aventi una massa elevata viaggiano nel tubo di volo con velocita ridotta, arrivando con ritardo al rivelatore rispetto a ioni piu piccoli.

33 Componenti di uno spettrometro di massa Camera di ionizzazione MALDI, ESI Analizzatore Analizzatore a tempo di volo, quadrupolo Rivelatore Fotomoltiplicatore, elettromoltiplicatore

34 Esempio di rivelatore: moltiplicatore di elettroni Uno ione dall analizzatore Serie di dinodi 10 6 elettroni L urto di un singolo ione proveniente dall analizzatore causa una cascata di elettroni. L impulso elettrico viene successivamente digitalizzato

35 Spettrometro MALDI-TOF Ionizzazione MALDI TOF Rivelatore Laser Segnale amplificato Piastra metallica Intensita Tempo (m/z)

36 Spettro MALDI-TOF di una Fosfoproteina phosphorylation Rel. Intensity No phosphorylation phosphorylations m/z Delta mass = 80 Da

37 MALDI-TOF MS in microbiology

38 MALDI-TOF MS in microbiology

39 Spettrometro ESI-TOF La ionizzazione MALDI e pulsata (con la frequenza del laser), percio si presta bene per essere collegata ad un analizzatore TOF. ESI e una sorgente continua di ioni. L accoppiamento ESI-TOF richiede una speciale geometria che unisca la sorgente continua di ioni con un analisi TOF di tipo pulsato (geometria ortogonale).

40 ESI-QqTOF analizzatore ibrido ESI pusher rivelatore Quadrupolo Quadrupolo 100 Intensita 0 m/z 1000

41 Filmato

42 Spettrometria di massa in tandem (MS/MS) ESI e MALDI generano ioni causando minima frammentazione nelle molecole. Questo implica che l unica informazione ottenibile dall analisi e una misura piu o meno accurata del peso molecolare dell analita. Cio non e sufficiente per una dettagliata caratterizzazione strutturale di peptidi e proteine (struttura primaria, modifiche post-traduzionali). E necessario usare la spettrometria di massa in tandem

43 Spettrometria di massa in tandem (MS/MS) La spettrometria di massa in tandem consiste nell effettuare una doppia analisi di massa su un determinato campione. Per fare cio, e possibile utilizzare due analizzatori in serie, o utilizzare lo stesso analizzatore a tempi diversi. MS1: spettro MS da 0 a 1000 m/z MS2: MS/MS su m/z Intensita Selezione del picco Intensita m/z m/z 1000

44 Qq-TOF : analisi MS/MS Da ESI pusher Rivelatore 100 Q0: selezione Q1: Camera di collisione Relative intensity (%) Full scan MS m/z 1000 Relative intensity (%) 0 m/z MS/MS su 1000

45 Analisi quantitativa: standard interno In spettrometria di massa quantitativa, viene fatto largo uso di standard interni contenenti isotopi pesanti non radioattivi (deuterio - D, 13 C). In figura è rappresentato uno ipotetico standard interno (D3) per la creatinina (a destra). Lo standard interno avrà efficienza di ionizzazione e ritenzione cromatografica praticamente identica alla creatinina, ma verrà rilevato ad un m/z maggiore (3 m/ z). Dal rapporto tra il segnale dell analita e quello dello standard interno si potrà risalire alla concentrazione incognita dell analita

46 Newborn Screening workflow MS spectrum Flow injection MS Take supernatant

47 Free carnitine PKU MSUD Homocystinuria Citrullinemia GA-I CPT-I/II VLCAD SCAD ASA PMA/MMA

48 Free carnitine PA/MMA GA-I CPT-I/II VLCAD PKU MSUD Omocisteinuria Citrullinemia Argininemia MCD C5-DC

49 PKU

50 Casi positivi PKU GA-I Sandra et al. J Perinat Neonat Nurs 2004

51 Deficit di MCAD

52 Casi positivi GA-I

53 Identificazione di proteine mediante spettrometria di massa La determinazione del peso molecolare della proteina intatta non e un informazione sufficiente. Nonostante nuove tecniche basate sulla frammentazione di proteine intatte siano in rapida evoluzione, generalmente l approccio standard per l identificazione di una proteina e l analisi spettrometrica del digerito triptico della proteina stessa.

54 Identificazione di proteine mediante spettrometria di massa Ricerca in banca dati Digestione triptica Analisi spettrometrica del digerito

55 Approccio 1: peptide mass fingerprinting (PMF) Il peso molecolare dei peptidi ottenuti mediante digestione triptica e analizzato tramite spettrometria di massa. La lista dei pesi molecolari di un buon numero di peptidi triptici ( > 5) e spesso un informazione sufficiente per identificare una proteina (o, piu specificatamente, il gene da cui essa proviene).

56 PMF: esempio Digestione triptica Lys, Arg Pesi molecolari rilevati sperimentalmente 100 Intensita (%) m/z 2000 Spettro MALDI-TOF

57 PMF: esempio La lista di peptidi acquisita sperimentalmente viene confrontata con i digeriti teorici presenti nella banca dati Dato sperimentale??? Digeriti triptici in silico: peso molecolare previsto per i peptidi triptici appartenenti a tre proteine modello Citocromo C Mioglobina Lattalbumina

58 MS/MS di peptidi Nello spettrometro di massa, durante esperimenti MS/MS, i peptidi tendono a frammentare in corrispondenza del legame ammidico. M b y M b y

59 MS/MS di un peptide T A S K Thr-Ala-Ser-Lys MS/MS T A A S S S K K T A A S T K Spettro MS Spettro MS/MS Intensita 405 Intensita m/z m/z 500

60 MS/MS di peptidi b 1 b 2 b 3 H 2 N R 1 O H N R 2 O N H R 3 O H N R 4 O OH y 3 y 2 y 1 Per un peptide composto da n ammino acidi: Inoltre: b 1 = M res H b 2 = b 1 M res b n-1 = MH M res y 1 = M res 18 H y 2 = y 1 M res y n-1 = MH - M res - H 2 O nel caso di D, E, S, T - NH 3 nel caso di N, Q, K, R

61 MS/MS di peptidi Per interpretare uno spettro MS/MS di un peptide, si parte in genere da un estremo, superiore o inferiore, dello spettro, cercando di individuare potenziali serie di ioni b o y. Le differenze tra i vari ioni b (o y) nella serie, corrispondono alle masse residue degli amminoacidi componenti la sequenza del peptide. Attenzione: la frammentazione e piu o meno favorita in diversi punti della sequenza del peptide; l intensita dei frammenti risultanti sara dunque variabile ( e spesso il frammento potrebbe essere assente, interrompendo la serie). Intensita y N y L y G y GLN m/z

62 MS/MS di peptidi b 1 = M res H y 1 = M res 18 H Masse residue di alcuni ammino acidi b 2 = b 1 M res b n-1 = MH M res b 1 b 2 b 3 y 2 = y 1 M res y n-1 = MH - M res Ala 71 Pro 97 Thr 101 Val 99 H 2 N R 1 O H N R 2 O N H R 3 O H N R 4 O OH Leu 113 Asn 114 Lys 128 Phe 147 y 3 y 2 y 1 Intensita M H m/z

63 MS/MS di peptidi b 1 = M res H b 2 = b 1 M res b n-1 = MH M res y 1 = M res 18 H Ala Asn Lys Leu - Phe y 2 = y 1 M res Ala 71 y n-1 = MH - M res Pro 97 Masse residue di alcuni ammino acidi Leu 113 Asn 114 Thr 101 Val 99 Lys 128 Phe 147 Intensita y b 2 b y y b MH - H 2 O y M H m/z

64 Identificazione di proteine approccio 2: MS/MS ion search Digestione triptica MS/MS ion search (2) 100 Intensita (%) PMF (1) 0 m/z 2000 Spettro MS

65 Identificazione di proteine tramite MS/MS 100 Intensita (%) Intensita (%) m/z Intensita (%) m/z Intensita (%) 0 Intensita (%) m/z m/z Intensita (%) 0 m/z m/z

66 Spettro MS/MS di un peptide acetilato 100 b 2 b 4 o b 7 b 10 o b 12 b 13 b 14 b 15 Y L S T P I F S K(Ac)L A Q W S N K y 12 Relative Abundance b y y 14 y 13 y 12 y 11 y 10 y 9 y 8 y 7 y 6 y 5 y 4 y 3 b 4 o y 10 [M2H-2H y 2 O] y y 5 y 6 y [M2H-H 2 O] b 7 y 8 b 12 b o 10 b12 o y y b b 14 b m/z

67 HPLC-ESI-MS Miscele complesse di peptidi non possono essere analizzate direttamente mediante spettrometria di massa. Tali miscele sono analizzate in maniera piu efficace tramite cromatografia liquida HPLC accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS). Un normale spettrometro di massa e capace di analizzare simultaneamente circa peptidi. Utilizzando LC-MS, le miscele peptidiche possono arrivare a contenere migliaia di componenti diversi.

68 HPLC-ESI-MS Fase mobile Campione Colonna HPLC ESI Spettrometro di massa

69 Analisi proteomica Lo studio qualitativo e quantitativo delle proteine contenute in un dato tessuto, coltura cellulare o fluido biologico. Tale studio puo riguardare rapporti quantitativi tra le proteine stesse, modificazioni posttraduzionali, interazioni tra proteine.

70 Analisi Proteomica Mediante nanolc-esi-ms/ms DIgestione triptica Miscela di Proteine Miscela di peptidi nanolc-esi-ms/ms analysis 100 Identificazione di centinaia/ migliaia di sequenze peptidiche, riconducibili a centinaia di proteine diverse RIcerca in banca dati Relative Abundance m/z Migliaia di spettri MS/MS

71 Quantitative Phosphoproteomics Reveals a Cluster of Tyrosine Kinases That Mediates Src Invasive Activity in Advanced Colon Carcinoma Cells Cancer Research, 2009 The nonreceptor tyrosine kinase Src is frequently overexpressed and/or activated in human colorectal carcinoma (CRC), and its increased activity has been associated with a poor clinical outcome. Src has been implicated in growth and invasion of these cancer cells by still not well-known mechanisms. Here, we addressed Src oncogenic signaling using quantitative phosphoproteomics. Src overexpression increased growth and invasiveness of metastatic SW620 CRC cells. Proteomic analysis revealed that Src phosphorylates a cluster of tyrosine kinases which were required for its invasive activity. Targeting these tyrosine kinases may be of significant therapeutic value in this cancer. 0 Cellule tumorali A G H I ps K P L R m/z Identificazione e quantificazione Estrazione proteine Isolamento fosfoproteine