Spettrometria di massa

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1 Spettrometria di massa Serve a misurare la massa delle molecole. Fornisce la massa molecolare, e anche la formula molecolare La molecola deve essere ionizzata, così da misurare il rapporto massa/carica (m/z) dello ione risultante. Sorgente Analizzatore Detector La sorgente serve a volatilizzare e ionizzare il campione L'analizzatore serve a misurare il rapporto m/z degli ioni prodotti Il detector serve a rivelare gli ioni che arrivano dall'analizzatore

2 Le diverse tecniche in cui è suddivisa la MS differiscono principalmente per due fattori: 1. Il modo in cui la molecola è ionizzata 2. Il modo in cui è misurato il rapporto massa/carica Sorgente Analizzatore Sorgenti: Sorgente EI (Ionizzazione Elettronica o Impatto Elettronico) Sorgente CI (Ionizzazione Chimica) Sorgente FAB (Fast Atom Bombarment) Sorgente ESI (ElectroSpray Ionization) Sorgente MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization) Analizzatori: Analizzatore magnetico Analizzatore a quadrupolo Analizzatore a trappola ionica (ion-trap) Analizzatore TOF (time of flight tempo di volo)

3 Ionizzazzione Nella spettrometria di massa si introduce una piccola quantità di composto nella sorgente nella quale il composto è vaporizzato e poi ionizzato MeccanismidiIonizzazzione Espulsionedie - : M M +. + e - Protonazione: M + H + MH + Deprotonazione: MH M - + H + Cationizzazione: M + Cat + MCat +

4 Sorgente EI (impatto elettronico) Sorgente CI (ionizzazione chimica) volatilizzazione Sorgente FAB (fast atom bombarment) SorgenteMALDI Sorgente electrospray Senza volatilizzazione La volatilizzazione è un grande limite per le molecole polari e con elevato peso molecolare Ogni tipo di sorgente è buona per certi tipi di composti e ogni tipo di sorgente genera ioni differenti!!!

5 Metodi di ionizzazione-classificazione EI Ionizzazione per impatto elettronico FAB MALDI Ionizzazione per desassorbimento ESI Ionizzazione per nebulizzazione -Molecole piccole -Termicamente stabili -Volatili -Molecole grandi -Termicamente poco stabili -Non volatili

6 Sulla base dell energia coinvolta, alcune tecniche di ionizzazione operano ad alta energia e portano ad una frammentazione spinta, altre operano a bassa energia producendo un numero inferiore di ioni.

7 Tecniche di ionizzazione Hard Ionizzazione elettronica Electron Ionization (EI) Modalità di ionizzazione Tecniche di ionizzazione Soft Ionizzazione chimica Chemical Ionization (CI) Bombardamento con atomi veloci Fast Atom Bombardment (FAB) Desorbimento laser assistito da matrice Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI) Ionizzazione elettrospray Electrospray Ionization (ESI)

8 Caratteristiche della Ionizzazione elettronica (EI) La ionizzazione elettronica (EI) risulta particolarmente utile per l analisi di molecole non polari (quindi volatili), termodinamicamentestabili (se per volatilizzarle è necessario riscaldare) e piccole ( 800 Da) -E una ionizzazione hard in quanto si usano elettroni accelerati daunpotenzialedi70ev. -Si possono quindi avere frammentazioni estese che lasciano poco o nulla dello ione molecolare Questo ha portato alla messa a punto di tecniche di ionizzazione a più bassa energia (ionizzazione morbida, "soft").

9 Caratteristiche della Ionizzazione chimica (CI) Può essere considerata come una variante della EI nella quale gli agenti ionizzanti sono costituiti da molecole di metano o di etano ionizzate per impatto elettronico. Risulta particolarmente utile per l analisi di molecole dotate di gruppi basici(ad esempio ammine o eteri) La sorgente CI genera lo ione per addizione di un protone e non per sottrazione di un elettrone come nell EI: non si avrà uno ione molecolare M + (o ione radicale) ma uno ione detto ione pseudomolecolare [M + H] + che è notevolmente più stabile di uno ioneradicale. La ionizzazione chimica ha il vantaggio di essere molto più soft della EI, quindi in genere si ottengono spettri nei quali lo ione pseudomolecolare è sempre visibile ed intenso (a causa della minore tendenza alla frammentazione). Ione molecolare sempre presente: informazione PM Minore frammentazione: scarse informazioni sulla struttura

10 La sorgente EI non va bene se il composto non è sufficientemente volatile Possibili rimedi: derivatizzazione (zuccheri e composti poliossidrilati; acidi carbossilici) R OAc Ac 2 O Py R OH Me 3 SiCl Py NaH, MeI R OSiMe 3 se la frammentazione è eccessiva e lo ione molecolare non è visibile Possibili rimedi: Energia di ionizzazione più bassa R OMe R COOH CH 2 N 2 R COOMe

11 In alternativa si possono usare altritipi di sorgenti in cui si ha una ionizzazione soft e non è richiesta la volatilizzazione SorgenteFAB SorgenteMALDI SorgenteESI

12 Sorgente FAB Sorgente MALDI Sorgente ESI Non richiedono volatilizzazione Desassorbimento: termine impiegato per descrivere il processo per cui una molecola viene sia evaporata da una superficie, sia ionizzata.

13 Tabella 1. Tecniche di ionizzazione per desassorbimento Tecnica di ionizzazione Bombardamento con atomi veloci (Fast Atom Bombardment, FAB) Ionizzazione laser assistita da matrice (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization, MALDI) Ionizzazione per elettronebulizzazione (Electrospray Ionization, ESI) Mezzo ionizzante Impatto di atomi a velocità elevata su un campione disciolto in una matrice liquida Impatto di fotoni ad alta energia su un campione inglobato in una matrice organica solida Formazione di particelle liquide cariche dalle quali gli ioni vengono emessi per desorbimento e/o desolvatazione

14 Ionizzazione per desassorbimento Sorgente FAB Sorgente MALDI Non richiedono volatilizzazione Per il FAB e MALDI, il campione viene desorbito e ionizzato mediante un processo che sfrutta il bombardamento della superficie del campione con atomi ad alta energia (FAB) o fotoni (MALDI). Nell impatto viene ceduta energia al campione, direttamente o tramite la matrice, e ciò porta al trasferimento delle molecole di campione in fase gassosa e alla loro ionizzazione.

15 Le molecole polari (come peptidi, glicosidi, saponine) possono essere analizzate mediante una tecnica soft o morbida di ionizzazione chiamata FAB (Fast Atom Bombardment-bombardamento con atomi veloci) Consiste nel disperdere il campione in una matrice (tipicamente glicerina) su cui vengono sparati atomi pesanti neutri ad elevata velocità.

16 FAB - Fast Atom Bombardment Il campione viene prima sciolto in un solvente protico(cioè in grado di cedere H + ) poco volatile detto matrice (es. glicerina, tioglicerina, trietanolammina, alcol 3nitrobenzilico). L introduzione di questa tecnica nei primi anni 80 ha rivoluzionato la spettrometria di massa, aprendola alla biologia e alla medicina. Adatto ad es. per peptidi, piccole proteine, altri biopolimeri(fino a 5000). Ionizzazione soft. Quantita minima circa 20 picomoli. Una goccia di questa soluzione è introdotta nella sorgente e qui viene bombardata da un flusso di atomi pesanti neutri ad alta energia cinetica circa 8-10 KeV(xenono argon) prodotti da una apposita pistola atomica

17 Lamatrice in cuièscioltoilcampione,èinvestitadaunflussodiatomineutridi Xeo Ar ad alta energia cinetica che provoca la volatilizzazione. Cioè gli atomi di Xe colpiscono la matrice e trasferiscono la loro energia cinetica sia alle molecole di solvente che di soluto (la volatilizzazione è un processo meccanico di trasferimento di energia cinetica). Le molecole di campione vengono così spruzzate via dalla superficie si ha cioè desassorbimento, entrano nella fase gassosa, e vengono ionizzate, per protonazione o deprotonazione. Quindi una volta volatilizzate, le molecole di campione devono essere ionizzate. Per avere la ionizzazione si sfrutta il fatto che il solvente è protico cioè si possono avere equilibri acido-base tra matrice e analita e quindi insieme alle molecole neutre di soluto sono presenti molecole protonate o deprotonate del tipo[m+h]+ o[m-h]- Questi ioni pseudomolecolari [M+H] + o [M-H] - vengono accelerati dal potenziale elettrico(analogo a quello nella sorgente EI) presente nella sorgente ed inviati quindi all analizzatore.

18 Ma come vengono prodotti gli atomi neutri ad alta velocità? Gli atomi veloci sono prodotti dal cosiddetto cannone atomico in cui viene introdotto il gas, Ar o Xe, che per effetto di una sorgente elettronica, diventano Ar +. oppure Xe +.. Questi ioni vengono fatti entrare in una camera di collisione in cui è presente Argon o Xeno gassoso; gli ioni, urtando gli atomi cedono la loro energia cinetica generando così un flusso di atomi neutri che escono dalla camera di collisione ad elevata velocità ed impattano contro la matrice che contiene disperso il campione da analizzare. Alla fine della camera di collisione vi è un potenziale positivo che provvede a respingere eventuali ioni che non si siano scontrati con Xeo Ar gassoso.

19 Glicerolo C 3 H 8 O 3, m/z La matrice più usata nel FAB Scelta migliore per i composti polari Utilizzabile per FAB positivi e negativi Problemi per la formazione di addotti che complicano la lettura degli spettri Tioglicerolo C 3 H 8 O 2 S, m/z maggiore acidità più volatile del glicerolo Problemi per la formazione di addotti che complicano la lettura degli spettri La scelta della matrice è molto importante perché potrebbe non aversi la ionizzazione

20 Il FAB è adatto a molecole polari, che possono subire reazioni acido-base: glicosidi, peptidi, oligonucleotidi, alcaloidi. Lo spettro FAB forma ioni stabili(tecnica di ionizzazione soft): lo ione molecolare è sempre visibile ed intenso, ma sono spesso visibili anche picchi di frammentazione (soprattutto per molecola grandi) che possono dare utili informazioni strutturali. Oltre allo ione pseuomolecolare [M+H] +, nel FAB + sono spesso visibili ioni del tipo [M+Na] + e [M+K] +, dovute all addizione alla molecola di uno ione Na + o K + invece chediunprotone.

21 Un problema del FAB è l elevato rumore di fondo: anche la matrice (S) ionizza e dà luogo ad un intenso picco [S+H] +, e anche picchi del tipo [2S+H] +, [3S+H] +, [4S+H] +, [5S+H] + (m/z 93, 185, 277, 369, 461, ecc per la glicerina) oligomeri della matrice protonati. Si possono incontrare problemi con sostanze con peso molecolare al di sotto di 400, poiché al di sotto di questo valore il rumore di fondo è molto elevato. Questo rappresenta il limite di massa inferiore Il limite di massa superiore dipende invece essenzialmente dalla capacità dell analizzatore.

22 Limite di massa inferiore e limite di massa superiore Il limite di massa inferiore è intorno a 400 Da per cui il FAB è adatto a molecole molto piccole. Ciò è dovuto al fatto che si ha un elevato rumore di fondo dovuto alla presenza della matrice che ionizza (monomero, dimero tetramero ecc ) Questi picchi rendono difficile l interpretazione dello spettro soprattutto a masse basse (diciamo minori di 300 Da), per cui il FAB è poco adatto a molecole molto piccole. Il limite di massa superiore, dipende essenzialmente dalla capacità dell analizzatore che nel FAB e un analizzatore magnetico. Rappresenta il valore di m/z che può essere misurato da uno spettrometro, è intorno a 3000 Da. Il campo magnetico ha un valore max oltre il quale non può andare!!!!

23 Limite di massa registrabile superiore: 3000 Dalton Limite di massa registrabile inferiore: 200 Dalton Interferenza della matrice

24 Fast Atom Bombardment (FAB)

25 Fast Atom Bombardment (FAB)

26 6 -Spettrometria di massa2.pdf V 2.0 Metodi Spettroscopici in Chimica Organica Prof. A. Mangoni A.A. 2007/2008

27 6 -Spettrometria di massa2.pdf V 2.0 Metodi Spettroscopici in Chimica Organica Prof. A. Mangoni A.A. 2007/2008

28 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (ionizzazione per desassorbimentomediante laser assistito dalla matrice)

29 Il MALDI è una tecnica di ionizzazione soft e ionizza bene sia piccole molecole che macromolecole senza provocare frammentazione. La ionizzazionedella molecola da analizzare è indotta da un brevissimo (dell ordine dei ns) ma intenso impulso di luce laser ultravioletta.

30 Il campione da analizzare viene disperso in una matrice. E preparato sciogliendo l analita e la matrice in un solvente organico volatile. Una goccia (1 µl o meno) della soluzione è posta su di uno dei pozzetti del target (una piastra di acciaio) e lasciata evaporare. La matrice cristallizza formando una soluzione solida con l analita.

31 Le matrici più utilizzate sono: 1. acido 2,5-diidrossibenzoico-DHB o acido gentisico 2. acido 3,5-dimetossi-4-idrossicinnamico o acido sinapinico 3. Acido α-ciano-4-idrossicinnamico-hcca

32 La ionizzazione MALDI prevede l irradiazione con una luce laser ultravioletta (λ 337 nm) di una piccola superficie (100 µm di diametro) in cui è posto il campione, cristallizzato con una matrice, con conseguente riscaldamento dell area di irradiazione e vaporizzazione delle molecole organiche.

33 La matrice svolge una duplice azione: assorbe energia dall irradiazione della luce laser e conseguentemente riscalda il pozzetto. agisce come donatore di protoni formando ioni pseudomolecolaridi tipo [M+H] +. Per composti con una elevata affinità per i cationi si possono formare anche addotti di tipo [M+Na] +, [M+K] +.

34 Per essere efficace, la radiazione ultravioletta deve essere assorbita, per cui il campione è cocristallizzato con una matrice solida che assorbe alla lunghezza d onda(337nm)prodottadaunlaseradazoto. L impulsoèconcentratosuunasuperficiedipochiμm 2,econun microscopiosipuò scegliere il punto esatto del cristallo su cui mandare l impulso laser. Il campione assorbe l energia dell impulso laser e la cede alla molecola, che viene così ionizzata e volatilizzata. Si formano ioni pseudomolecolari a singola carica positivi e negativi.

35 La matrice assorbe l energia dal laser e la cede alle molecole di analita, che vengono espulse come ioni positivi (tutte le matrici viste sono acide, e possono protonare l analita). Le molecole di campione vengono cosi spruzzate via dalla superficie si ha cioè desassorbimento, entrano nella fase gassosa, e vengono ionizzate, per protonazione o deprotonazione. Con matrici basiche (per esempio 2-ammino-5-nitropiridina) si possono anche ottenere ioni negativi.

36 Affinchè una molecola possa essere utilizzata come matrice MALDI è necessario che contenga un cromoforo in grado di assorbire la radiazione elettromagnetica emessa dalla sorgente laser. Cromoforo: la parte della molecola responsabile dell'assorbimento UV (per esempio, un carbonile α,β insaturo)

37 Sorgente MALDI- Analizzatore TOF La sorgente MALDI è una sorgente impulsiva: non genera un flusso continuo di ioni, ma una grande quantità di ioni in pochissimo tempo. Nel MALDI si usa un particolare analizzatore, l analizzatore a tempo di volo(tof = time offlight). L analizzatore TOF è un tubo rettilineo di cm. Ad un estremità del tubo c è un campo elettrico, che accelera gli ioni provenienti dalla sorgente. Gli ioni attraversano poi una regione rettilinea senza campo che è l analizzatore. Quindi ogni ione continua a viaggiare con la velocità acquisita nella zona di accelerazione. Gli ioni sono sottoposti tutti allo stesso campo elettrico, e assumono la stessa energia cinetica.

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39 Gli ioni prodotti dalla sorgente vengono accelerati da un potenziale di accelerazione che conferisce a tutti la stessa energia cinetica. Gli ioni vengono focalizzati verso un tubo di volo (fly tube o drift tube) Dato che l energia cinetica è Minore sarà la massa dello ione, maggiore sarà la sua velocità Per cui impiegheranno tempi differenti per percorrere un determinato spazio L t = (m/2zvacc) 1/2 L Elaborando questa espressione si ottiene la relazione tra tempo di volo e rapporto massa/carica: t = a (m/z) 1/2 + b Gli ioni più LEGGERI percorrono il tubo di volo e raggiungono il rivelatore prima di quelli PESANTI

40 Questo analizzatore misura il rapporto m/z degli ioni sulla base del tempo che essi impiegano ad arrivare al detector. Gli ioni con rapporto m/z maggiore (più pesanti) assumono una velocità minore rispetto agli ioni con rapporto m/z minore (più leggeri), e quindi impiegano più tempo ad arrivare al detector.

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42 Il detector Il detector converte l energia cinetica delle particelle in arrivo in segnale elettrico. Sia ioni che particelle neutre dotate di energia cinetica passano attraverso la zona di volo alla cui fine è posto un dinodo. Quest ultimo rappresenta una speciale superficie capace di emettere una corrente di elettroni in risposta all urto con una particella dotata di energia cinetica. A causa di una differenza di potenziale positiva, la corrente elettrica giunge ad un secondo dinodo e causa un rilascio di corrente amplificata.

43 Sorgente MALDI- Analizzatore TOF Spettro MALDI-TOF del citocromo C

44 Sorgente MALDI- Analizzatore TOF La sorgente MALDI genera ioni a singola carica (al massimo 2-3 cariche per composti molto grandi) Non si ha frammentazione (e anche se avviene nell analizzatore non ce ne accorgiamo) Utilizzando una matrice adatta è possibile ionizzare praticamente qualsiasi composto (da piccole molecole organiche a intere proteine). L analizzatore TOF non ha praticamente nessun limite superiore per la massa analizzabile. (in un analizzatore magnetico solo gli ioni con un ben determinato rapporto m/z riescono ad arrivare al detector, gli altri sono eliminati) L analizzatore TOF è molto sensibile poiché tutti gli ioni generati dalla sorgente arrivano al detector.

45 L analizzatore TOF, nella sua forma originaria, ha una risoluzione piuttosto bassa. La causa fondamentale della bassa risoluzione è che in seguito all impulso del laser gli ioni vengono espulsi dalla matrice in tutte le direzioni e già con una certa velocità, e questa differenza di velocità si conserva anche dopo l'acceleratore di ioni, per cui ioni con lo stesso rapporto m/z possono arrivare al detector in tempi leggermente diversi. Esempio di spettro MALDI di una miscela di proteine, in cui sono evidenti sia gli alti rapporti m/z raggiungibili dall analizzatore TOF, che la relativa larghezza dei picchi dovuta alla bassa risoluzione.

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47 Il time delayed extraction(estrazione ritardata) si usa per evitare che ioni dello stesso tipo partano in tempi diversi dalla matrice. Ciò è dovuto al fatto che il laser riscalda prima una certa zona del pozzetto i cui ioni partiranno logicamente prima di quelli ottenuti da zone più lontane da quella di incidenza del laser

48 Il delayedextractionconsiste nell applicare un voltaggio prima della zona di accelerazione così da focalizzare tutti gli ioni di stesso m/z

49 ..è come il Palio: primo lo sparo (il laser), e i cavalli si allineano al canapo, e poi la partenza

50 in alternativa.. Analizzatore TOF: Reflectron Il problema della scarsa risoluzione è stato quasi completamente risolto negli apparecchi più recenti, con accorgimenti tecnologici come il reflectron (riflettore elettrostatico), che permette un netto miglioramento della risoluzione. Il reflectron è uno specchio elettrostatico: un potenziale positivo devia gli ioni di quasi 180. Ioni con energia cinetica maggiore (più veloci) riescono ed entrare più in profondità nel reflectron, percorrono una traiettoria più lunga, e quindi passano più tempo nel reflectron. Questo tempo in più è pari al tempo in meno che gliioni più veloci impiegherebbero ad arrivare al detector.

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