Le analisi chimiche e tossicologiche

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1 3^ SESSIONE Aspetti di tossicologia forense Le analisi chimiche e tossicologiche Prof. Letizia Antonilli Laboratorio Sezione di Farmaco-Tossicologia UOC Patologia Clinica Umberto I Policlinico di Roma - «Sapienza» Università di Roma

2 Summary Analisi chimico-tossicologiche e loro ruolo nel percorso diagnostico clinico e medico legale Procedure di accertamento implicazioni ed applicazioni Parametri di laboratorio

3 L analisi chimico-tossicologica L analisi tossicologica è una parte essenziale nel processo diagnostico clinico e medico legale essendo mirata a ricercare l evidenza della presenza di sostanze psicoattive nei fluidi biologici Metodi analitici con elevato potere identificativo sono necessari al fine di poter ottenere più informazioni possibili da una singola analisi Le conseguenze penali che possono derivare dai risultati provenienti dal laboratorio si traducono nella necessità di ottenere un dato analitico altamente attendibile Il laboratorio analitico deve seguire linee guida nazionali e/o internazionali nonché avere misure di verifica e accreditamento esterno Le linee guida internazionali specificano che nel caso di analisi finalizzate a scopi medico-legali, le fasi analitiche previste siano fondamentalmente due, basate ciascuna su principi chimico-fisici differenti cioè ortogonali tra loro

4 Obiettivo dell indagine analitica Ottenere da un dato scientifico tutte le informazioni utili per supportare correttamente il processo diagnostico clinico e medico legale. Particolare attenzione deve essere posta: alla validità e al controllo delle procedure operative ai criteri di scelta dei metodi di analisi alla valenza diagnostica e agli eventuali aspetti di natura medico-legale correlati alla gestione del risultato analitico 4

5 Quali informazioni dovrebbe fornire l analisi Quali sostanze / gruppo di sostanze si vogliono ricercare In quali concentrazioni sono presenti nella matrice biologica A quale periodo di tempo si può riferire l esposizione Tipo di matrice Tipo di procedura analitica 5

6 Scelta della matrice biologica 6

7 Intervallo di rilevabilità nelle urine SOSTANZA MDMA (ecstasy) Metamfetamina Cocaina Benzoilecgonina Cocaetilene Morfina Codeina TEMPO ore 48 ore 6-8 ore ore > 20 ore 24 ore 24 ore 6 monoacetil morfina (6-MAM) 2-4 ore Morfina glucuronidi 48 ore Buprenorfina ore -9-tetraidrocannabinolo Uso saltuario - moderato 3 4 giorni Uso giornaliero Uso cronico 10 giorni fino a 36 giorni Fenciclidina Ketamina 8 giorni 72 ore 7

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9 Fasi dell indagine analitica analitica Richiesta di analisi Campione biologico Sangue Urina Capelli Saliva Metodi analitici Interpretazione del risultato 9

10 La richiesta di analisi Dati del richiedente Dati dell utente Data, ora e firma di chi effettua il prelievo Elementi circostanziali (terapia in atto, esposizione attuale o pregressa a farmaci o a sostanze d abuso, segni sintomatologici.) Finalità dell analisi Documentazione allegata : consenso informato catena di custodia 10

11 Metodi Immunochimici Metodi sensibili Individuano le classi di sostanze : specificità non assoluta L anticorpo può cross-reagire con molecole strutturalmente correlate con l analita di interesse Altre sostanze esogene o componenti della matrice possono interferire con il segnale analitico Non richiedono un pretrattamento del campione: semplicità operativa e rapidità di esecuzione 11

12 Principio della reazione antigene-anticorpo

13 Y EROINA MORFINA CODEINA 13

14 Interferenze e Reattività crociata SOSTANZA AGENTE INTERFERENTE RISULTATO CAUSA Oppiacei Fluorochinolonici Falso positivo Interferenza Rifampicina Falso positivo Interferenza Metadone Verapamil Falso positivo Non identificata FANS Falso positivo Interferenza Cannabinoidi Ibuprofene,Naproxene Falso positivo Interferenza Cocaina Salicilati Falso negativo Interferenza Amfetamine Efedrina Falso positivo Cross-reattività Norpseudoefedrina Falso positivo Cross-reattività Clorpromazina Falso positivo Interferenza Statine Falso positivo Interferenza 14

15 nessuna tecnica di screening è in grado di rilevare tutte le sostanze xenobiotiche di interesse medico-legale, quindi a seconda delle singole esigenze è necessario utilizzare più metodi analitici. «NON PUO AVERE VALIDITA FORENSE UN RISULTATO POSITIVO OTTENUTO ATTRAVERSO UN ANALISI DI SCREENING. E PERTANTO INDISPENSABILE CHE TALE RISULTATO SIA VERIFICATO MEDIANTE UN ANALISI DI CONFERMA» * *

16 Analisi di conferma: Metodi cromatografici Sensibilità: elevata Specificità: elevata molto elevata Richiedono l isolamento degli analiti dalla matrice Determinazione quantitativa : precisa ed accurata Tempi di esecuzione maggiori rispetto ai metodi immunochimici 16

17 Area CROMATOGRAMMA Cromatografia Liquida ad Elevata Prestazione (HPLC) C B A INIETTORE A,B,C Tempo di ritenzione (min) POMPA COLONNA A B C RECORDER DETECTOR SOLVENTE 17

18 Cromatografia su strato sottile ad alta prestazione (HPTLC) AU sample Fronte del solvente standard nm C AU A B C B A Rf campioni standards solvente

19 Spettrometria di massa tandem (m/z) Cocaina 304 (m/z) 82 (m/z) 19

20 Cosa ci dice la spettrometria di massa? le sostanze sono identificate in base al loro peso molecolare e ai frammenti chimici che si originano per impatto con elettroni prodotti ad alta velocità Si può misurare accuratamente il peso molecolare, fino alla quarta cifra decimale Si possono ottenere per ciascun composto dei profili di frammentazione specifici e che costituiscono la loro inequivocabile impronta digitale

21 LA SPETTROMETRIA DI MASSA, ACCOPPIATA AD UNA METODICA CROMATOGRAFICA, E UNIVERSALMENTE RICONOSCIUTA DALLE ASSOCIAZIONI SCIENTIFICHE FORENSI COME TECNICA IDENTIFICATIVA DI ELEZIONE PER LE ANALISI DI CONFERMA

22 Parametri di laboratorio Tutti i metodi analitici sono principalmente definiti da due variabili : Sensibilità : capacità del metodo rilevare la minima concentrazione di analita significativamente diversa dal bianco Specificità : capacità del metodo di rilevare la presenza dell analita, in una miscela complessa, senza subire interferenze da parte di altri componenti presenti 22

23 Concetto di cut-off Limite di concentrazione definito in maniera convenzionale per: stabilire la negatività o la positività in un campione garantire la confermabilità dei risultati positivi con tecniche alternative dotate di maggiore sensibilità e specificità 23

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27 Quali sostanze Classe Oppiacei Sostanza Morfina Morfina glucuronide 6-Monoacetilmorfina Codeina Diidrocodeina Cocaina metaboliti Cocaina Benzoilecgonina Ecgonina metilestere Cocaetilene Cannabinoidi Amfetamine ed analoghi Delta-9-THC Cannabidiolo Amfetamina Metamfetamina MDMA (ecstasy) MDA Alcool e metaboliti Etanolo Etilglucuronide Ketamina New drugs : Cannabinoidi sintetici, Catinoni, preparati erboristici ecc..

28 Determinazione dell alcolemia Metabolismo dell etanolo CH3-CH2-OH Alcol deidrogenasi NAD CH3-COH Aldeide deidrogenasi NAD CH3COOH + NADH H H O H O COOH H H H O O H H O C H 2 C H 3 Etil-glucuronide (0.06%) 28

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30 Gas cromatografia dello spazio di testa: determinazione dell alcolemia Analisi di composti volatili anche in tracce Si inietta in colonna il vapore che si trova in equilibrio termodinamico con il campione da analizzare lavora su una frazione arricchita delle specie chimiche Si realizzano così analisi molto precise e riproducibili 30

31 CONCLUSIONI Le indagini analitiche per identificare e determinare sostanze stupefacenti in matrici biologiche riguardano diversi settori in ambito clinico e con implicazioni medico legali Integrazione tra metodologie analitiche diverse IMMUNOCHIMICHE CROMATOGRAFICHE AFFIDABILTA DEL DATO DI LABORATORIO SUPPORTO DEL PERCORSO DIAGNOSTICO CLINICO E MEDICO LEGALE