Aspetti di base di Spettrometria di Massa

Transcript

1 Aspetti di base di Spettrometria di Massa Cenni storici Utilizzo della SM Componenti dello SM: 1-Sistemi di introduzione del campione 2-Tecniche di ionizzazione: EI CI 3-Analizzatori di massa: magnetici quadrupoli a filtro di massa 4-Rivelatori 5-Sistema di vuoto 6-Data system. Accoppiamento GC-MS Analisi qualitativa: linee guida per l interpretazione degli spettri

2 Cos è uno Spettrometro di Massa? Uno strumento per misurare la Massa delle Molecole

3 Cos è uno Spettrometro di Massa? Uno strumento per misurare la Massa delle Molecole (m/z)

4 Informazioni ottenibili con la SM Fornisce informazioni riguardanti: Massa molecolare di molecole organiche con una accuratezza di 5ppm (conferma formula molecolare) La composizione qualitativa e quantitativa di analiti sia organici che inorganici in miscele complesse. La struttura di specie molecolari complesse: conferma e/o identificazione di molecole note o sconosciute. I rapporti isotopici degli atomi nei campioni. La struttura e la composizione delle superfici solide.

5 Campi di applicazione della SM Where are Mass Spectrometers Used? Biotechnology: the analysis of proteins, peptides, oligonucleotides, Pharmaceutical: drug discovery, combinatorial chemistry, pharmacokinetics, drug metabolism, Clinical: neonatal screening, haemoglobin analysis, drug testing, Environmental: PAHs, PCBs, water quality, food contamination, Geological: oil composition,

6 Applicazioni della GC-MS in Chimica Clinica Ricerca di: Droghe d abuso e Farmaci Oppiacei/Oppioidi : Eroina, Codeina, Diidrocodeina, Metadone, Tramadol (principio attivo Valaron), Analgesici periferici Benzodiazepine: Diazepam, Flunitrazepam, Bromazepam (Ipnotici-Sedativi) Barbiturici Altri sedativi Anti-istaminici Anfetamine e sostanze correlate (stimolanti il sistema nervoso centrale) Cannabis Cocaina Allucinogeni

7 Applicazioni della GC-MS in Chimica Clinica Controllo qualità: metodi di riferimento o definitivi Analisi proteine modificate: emoglobinopatie Medicina del Lavoro Benzene, Toluene, Xilene Fenoli VOCs (Volatile Chlorinated Organic Compounds)...

8 Applicazioni della LC-MS/MS in Chimica Clinica

9 LO SPETTROMETRO DI MASSA Determina la massa delle molecole, dopo che sono state ionizzate. Non misura direttamente la massa molecolare, ma il rapporto massa/carica (m/z) degli ioni derivanti dalle molecole La carica di uno ione è espressa come il numero di cariche elementari (z) e il rapporto massa/carica è espresso come Da per unità elementare di carica La maggior parte degli ioni che si riscontrano in spettrometria di massa possiede una sola carica (z = 1), quindi il loro valore di m/z coincide con il valore della massa dello ione

10 Limiti della SM Il campione deve essere portato allo stato gassoso ed ionizzato Le specie ioniche devono essere trasportate, separate e rilevate. Deve lavorare con un vuoto elevato Il cammino libero delle traiettorie degli ioni deve essere massimizzato. Deve essere capace di misurare la massa di ioni. Valutate come rapporto massa/carica.

11 Funzioni dei componenti di uno SM Sorgenti ioniche: Generazione ioni Collimazione del fascio ionico Analizzatori Separare gli ioni in base al rapporto m/z Focalizzare ioni a m/z uguale. Rivelatori Convertire il fascio di ioni in segnale elettrico

12 SPETTROMETRIA DI MASSA COMPUTER X Sistema di introduzione DIS GC HPLC PB ESI API EI CI ESI APCI X - come introdurre il campione A - come produrre ioni B - come separare questi ioni C - come visualizzare gli ioni A Sorgente ionica B Analizzatore Magnetico Quadrupolare IT (Ion Trap) ICR (Ion Cyclotron Resonance) TOF (Time of Flight) Sistema da vuoto C Rivelatore EM - FM

13 Spettro di massa Introduzione Sorgente ionica Analizzatore Rivelatore + + +

14 Sistema da vuoto Necessita per: L ossigeno potrebbe bruciare il filamento Elevata pressione di gas residui produce uno spettro di massa che interferisce con quello del campione Possono avvenire reazioni ione-molecola indesiderate che cambiano l aspetto dello spettro Due sistemi di pompaggio: 1. Vuoto preliminare con pompe rotative meccaniche torr. 2. Pompe a diffusione o turbomolecolari torr.

15 Pompe rotative: basso vuoto

16 Pompe da alto vuoto

17 Sistemi di introduzione Liquidi HPLC CE ecc. Solidi Sonde per solidi Gas Diretti o da GC

18 Sistemi di introduzione: diretta Sistemi per introdurre il campione (solido-liquido-gassoso) nella sorgente ionica evitando di fare entrare aria. Liquidi e Gassosi/Vapori Solidi e liquidi

19 Sistemi di introduzione indiretti accoppiamento con tecniche cromatografiche Vantaggi: Il potere informativo delle due tecniche sinergizza Aumenta la specificità di analisi (r.t. + spettro di massa) Permette l analisi di miscele complesse Aumenta la sensibilità: il campione entra nello SM in bande strette

20 Tecniche di ionizzazione Composti Metodi di ionizzazione Accoppiamenti Volatili EI GC-MS Poco polari EI CI GC-MS Polari EI CI GC-MS (derivati) Molto polari DCI- APCI- FI-TSP GC-MS derivati LC-MS Estremamente polari DCI-FAB-MALDI-ESI LC-MS

21 Tipi di ionizzazione Ionizzazione elettronica (EI) Ionizzazione chimica (CI) Positiva (PCI) Negativa (NCI)

22 Tipi di ionizzazione CI EI SOFT HARD Pochi frammenti Molti frammenti

23 Sorgenti ioniche: Generazione ioni Collimazione del fascio ionico

24 EI: sorgente ionica

25 TECNICHE DI IONIZZAZIONE 1 Ionizzazione elettronica (EI) (ex-impatto ELETTRONICO) Eccitazione della molecola per interazione con un elettrone ad alta energia (70 ev 1500 kcal/mole) - - e - M + rimozione di un e - : radicale cationico M + e M - cattura di un e - : radicale anionico + e -

26 TECNICHE DI IONIZZAZIONE 1 Ionizzazione elettronica o Interazione elettronica (EI) e - emessi da un filamento ed accelerati da una differenza di potenziale di 70eV 1500 Kcal/mol ( 1 ev 23 Kcal/mol) Potenziale di ionizzazione per molecole organiche 10 ev (6-13eV) Energia media di legame 75 Kcal/mol 3-4eV Energia trasferita 15 ev 345 Kcal/mol (10-20 ev Kcal/mol ) Eliminazione/cattura di un elettrone dalla molecola con formazione di ione positivo/negativo (ione molecolare = M + / M - ) es: C 10 H 22 + e - C 10 H e - odd electron - molecular ions Scissione di legami chimici con formazione di: frammenti (ioni a massa inferiore a quella dello ione molecolare)

27 EI Tipi di ioni: molecolari, frammenti, di trasposizione, metastabili, carica multipla, positivi/negativi, da reazione ione/molecola Ioni negativi Ioni frammento

28 Corrente ionica totale TECNICHE DI IONIZZAZIONE 1 EI m/z 40 m/z 40 M M Energia elettroni (ev) M M M + e - Σ Ioni (M + + ABC + + AB + + CD + + A + + B + +C +..)

29 EI: Ionization IE electron energy (ev) 70 ev sono tipicamente usati Ad energia più bassa si ha la formazione di un numero minore di frammenti e ioni. Ad energia elevata la frammentazione è così estesa che porta ad un ridotto numero di informazioni ERRATO!

30 EI: Ionization IE electron energy (ev) Ad ogni elettrone è associata un onda, con una propria lunghezza d onda λ data da :» λ= h /mv m = massa v = velocità h= costante di Plank Se λ =2.7 Å 20eV 1.4 Å 70eV CORRETTA: Ad alti valori di ev la lunghezza d onda è così piccola che le molecole diventano trasparenti a questi elettroni.

31 EI: Ionization IE electron energy (ev) 70 ev sono tipicamente usati CORRETTA: 1-Ad ogni e - è associata una lunghezza d onda. Ad alti valori di ev la lunghezza d onda è così piccola che le molecole diventano trasparenti a questi elettroni. 2-A 70eV piccole variazioni dell energia degli e - non modifica significativamente lo spettro

32 Tecniche di ionizzazione: CI

33 TECNICHE DI IONIZZAZIONE 2 IONIZZAZIONE CHIMICA (SOFT) Avviene se si introduce nella camera di ionizzazione un gas reagente (R) in concentrazioni relativamente elevate 200Pa Il gas reagente R è in eccesso rispetto al campione (C) presente in tracce C/R = 10-3 e la reazione tra R e C origina lo spettro di massa del composto Il gas dà luogo a ioni per interazione con gli e - CH 4 + e - CH e - (lenti) ionizz. gas reagente CH 4 + CH 4 + CH 5+ + CH 3 + reazione ione-molecola CH CH 4 C 2 H H 2 CH 4 + CH 3+ + H reaz. di frammentazione

34 TECNICHE DI IONIZZAZIONE 2 IONIZZAZIONE CHIMICA (SOFT) R + H + [RH] + La quantità di energia trasferita agli ioni del campione in CI è funzione della esotermicità, ΔH (calore di reaz) della reazione acido-base di trasferimento dei protoni. ΔH = - Δ PA = -[PA C = campione - PA R = gas reagente ] PA= affinità protonica ΔH = PA R -PA C -ΔH = PA R C + [R+H] + [C+H] + + R Se PA(C) > PA (R) reazione esotermica

35 SPETTRO DI MASSA EI/CI:ALCOOL 3-NITRO-BENZILICO Spettro EI M m/z Spettro CI MH m/z

36 CI: gas reagente Forte Gas reagente kcal/mole Principale specie reagente CH CH 5 + H 2 O 169 H 3 O + CH 3 OH 182 CH 3 OH 2 + Iso-C 4 H t-c 4 H 9+ NH NH + 4 Debole

37 TECNICHE DI IONIZZAZIONE 2 : PCI C + [R+H] + [C+H] + + R CH 4 = 5.7 PA = 8.7V Δ H = PA R -PA C i-c 4 H 10 = 8.5 NH 3 = 9V

38 CI Addotti con il gas reagente (es NH 4+ )

39 Riassumendo IONIZZAZIONE CHIMICA (SOFT) Lo spettro varia al variare del gas reagente (metano, isobutano, ammoniaca, ) La temp. della sorgente modifica l intensità dello ione La CI oltre agli ioni positivi (PCI), a differenza della EI, può produrre ioni negativi (NCI) molto apprezzabili specie se la molecola contiene gruppi elettron-attrattori. Il gas dà luogo a ioni per interazione con gli e - che, comportandosi da acidi (Brønsted): cedono un protone all analita in esame a) Proton transfer M + BH + MH + + B Gli ioni così formati sono detti: even-electron quasimolecular ions b) Charge exchange M + X + M + + X

40 NCI

41 NCI

42 Vantaggi: TECNICHE DI IONIZZAZIONE 2 : NCI Negative Chemical Ionization Aumento di sensibilità LOD ( volte) per aumento della intensità dello ione molecolare per miglioramento del rapporto segnale/rumore di fondo. Utile per composti con gruppi elettron-attrattori (nitro, alogeno e insaturi) L elettro-affinità può essere incrementata mediante reazione di introduzione (derivatizzazione) di gruppi elettrofili: perfluoroacili, perfluorobenzilici o nitrobenzilici.

43 CI VANTAGGI DELLA CI: Informazioni sul Peso Molecolare. Aumento della Selettività e Sensibilità (LOD) per molti composti. Sia la PICI che la NICI sono semplici nella messa in opera e nelle regolazioni.

44 Spettro di massa Introduzione Sorgente ionica Analizzatore Rivelatore + + +

45 Requisiti degli analizzatori di massa di uno SM Analizzatori di massa: Range di massa: valore di m/z massimo determinabile Risoluzione: capacità di separare ioni a m/z diversi Velocità di scansione: veloce per analisi in accoppiamento con tecniche cromatografiche, lento per determinazione della massa esatta. Efficienza di trasmissione

46 Requisiti degli analizzatori di uno SM Risoluzione - Potere risolutivo: utilizzare Isopro = R 0,01258 Methylnaphtalene 12 C 10 H 8 14 N 1 = Methylquinolene 12 C 11 H 10 = Methylquinolene 12 C 11 H 10 = C C 1 H 9 = C C 1 H 9 =

47 Requisiti degli analizzatori di uno SM Potere Risolutivo ( m) Capacità dello spettrometro di massa (analizzatore) di separare ioni di differenti valori di m/z. Se m 1 < m 2 (m 2 = m 1 + m) Risoluzione (RP) m 1 m 1 RP = = m 2 - m 1 m m m 1 m 2 m/z RP RP m/z m al 10% dell altezza (h) h m al 50% dell altezza h

48 Requisiti degli analizzatori di uno SM Accuratezza Capacità di valutare il valore di m/z più prossimo al vero Teorico Misurato Bias m/z m/z Risoluzione - Potere risolutivo (RP) Capacità dello spettrometro di massa (analizzatore) di separare ioni di differenti valori di m/z. Il RP ha un notevole impatto sulla accuratezza nella determinazione della massa esatta. [C 2 H 5 ].+ = [CO].+ = RP=770

49 Requisiti degli analizzatori di uno SM Risoluzione - Potere risolutivo Capacità dello spettrometro di massa (analizzatore) di separare ioni di differenti valori di m/z. R (ppm) = 10 6 ( m / m) Mr Bias Teorico Misurato amu ppm Sostanza P Risoluzione necessaria per separare: CO + da N + 2 Mr =28 R = 28/ = 2490 Se le molecole sono 10 volte più grandi: RCO + da R N + 2 Mr =280 R = 280/ = 24900

50 Massa molecolare esatta: molecular fragment calc. Esempio Massa molecolare Accuratezza 0.1 Accuratezza 0.01

51 Requisiti degli analizzatori di uno SM Risoluzione - Potere risolutivo (RP) Elevati poteri risolutivi permettono: Migliorare la determinazione della massa esatta. Separare le varie specie isotopiche in molecole marcate per la valutazione dell arricchimento isotopico. Separare il cluster isotopico per la valutazione di molecole ad elevato Mr in ioni multicarica. Migliorare l accuratezza in analisi quantitative. Selezionare in modo accurato lo ione precursore in analisi MS/MS.

52 Analizzatori Quadrupolo 80% of benchtop systems ( 3000/yr) HP, PE, TMQ, Shimadzu Trappole ioniche 20% benchtop systems ( 700/yr) Varian, TMQ Tempo di volo (ToF) currently a minor player (50-60/yr)( Leco, Micromass, TMQ Settore Magnetico Generalmente non benchtops

53 ANALIZZATORI 1 : Magnetico Gli ioni che escono dalla sorgente hanno identica E c =1/2mv 2 poiché subiscono la stessa accelerazione E p =zv (z=carica) Da cui E p = E c 1/2mv 2 = zv

54 ANALIZZATORI 1 : Magnetico Campo magnetico perpendicolare alla velocità = ione sottoposto alla forza F M F centripeta F centrifuga

55 ANALIZZATORI 1 : Magnetico F M = vzb F C = mv 2 /r Lo ione seguirà un moto circolare con raggio r tale che la forza centrifuga F C equilibra la forza magnetica F M Gli ioni che escono dalla sorgente hanno identica E c =1/2mv 2 poiché subiscono la stessa accelerazione E p =zv Da cui: 1/2mv 2 = zv (1) F magnetica = vzb F M = F C vzb = mv 2 /r Ricaviamo v v = z B r / m E sostituendo nella (1) F centrifuga = mv 2 /r

56 ANALIZZATORI 1 : Magnetico

57 ANALIZZATORI 1 : Quadrupolo1-quad2

58 ANALIZZATORI 1 : Quadrupolo Filtro passa alto Filtro passa basso + + Quad1 Quad2

59 ANALIZZATORI 1 : Quadrupolo T0 T1 T2 T3

60 Equazione moto ioni nel quadrupolo

61 Quadrupolo - Trappola ionica

62 Quadrupolo - Trappola ionica Radiofrequenza = V cos ώt Corrente continua = U

63 Trappola ionica

64 ANALIZZATORI 2 Trappola ionica Mass Spectrum

65 Rivelatori

66 Rivelatori

67 Informazioni strutturali tramite SM: interpretazione dello spettro di massa

68

69

70 Linee guida per l interpretazione degli spettri EI

71 Linee guida per l interpretazione degli spettri EI 1. Utilizzare tutte le informazioni disponibili: spettroscopiche (IR, UV etc) chimiche (analisi elementare,..) 2. Verificare la correttezza delle masse ed eliminare le impurezze 3. Identificare lo ione molecolare se presente Ione a massa più elevata Origina perdite neutre logiche 4. Utilizzando le abbondanze isotopiche dedurre la composizione elementare 5. Calcolare il grado di insaturazione (se nota la composizione) 6. Identificare la presenza di picchi isotopici caratteristici (Cl, Br, S, Si,..) 7. Utilizzare diverse tecniche di ionizzazione (CI, FAB, ) 8. Utilizzare l alta risoluzione per l ottenimento delle masse esatte. 9. Ricorre a derivati per la conferma della struttura 10.Studiare l aspetto generale ( stabilità molecolare, legami labili,.. 11.Segnare gli ioni a elettroni dispari importanti (serie caratteristiche, ) 12. Fare ipotesi di struttura per gli ioni principali 13. Confronto con dati presenti in banche dati o con prodotti puri

72 Linee guida per l interpretazione degli spettri EI 2. Verificare la correttezza delle masse ed eliminare le impurezze Verificare l assenza di artefatti ed errori (picchi saturi, SM non calibrato,..) Assicurarsi che lo spettro sia di un solo composto e non di una miscela Eliminare ioni derivanti da impurezze o fondo di colonna GC o da manipolazioni derivanti da processi di purificazione.

73 Linee guida per l interpretazione degli spettri EI 1. Utilizzare tutte le informazioni disponibili: spettroscopiche (IR, UV etc) chimiche (analisi elementare,..). 2. Verificare la correttezza delle masse ed eliminare le impurezze. 3. Identificare lo ione molecolare se presente Ione a massa più elevata Origina perdite neutre logiche 4. Utilizzando le abbondanze isotopiche dedurre la composizione elementare. 5. Calcolare il grado di insaturazione (se nota la composizione). 6. Identificare la presenza di picchi isotopici caratteristici (Cl, Br, S, Si,..). 7. Utilizzare diverse tecniche di ionizzazione (PCI, NCI, ). 8. Utilizzare l alta risoluzione per l ottenimento delle masse esatte. 9. Ricorre a derivati per la conferma della struttura. 10.Studiare l aspetto generale ( stabilità molecolare, legami labili, 11.Segnare gli ioni a elettroni dispari importanti (serie caratteristiche, ). 12. Fare ipotesi di struttura per gli ioni principali. 13. Confronto con dati presenti in banche dati o con prodotti puri.

74 Massa molecolare Calcolare la massa molecolare della CO 2 Calcolare la massa molecolare di C 5 H 12 Proviamo ad utilizzare un apposito programma: MM_Calc.

75 Massa molecolare Massa di un atomo di carbonio 12C = kg o 12 amu 1amu= kg Massa nominale (Nominal mass) = la massa dello ione molecolare calcolata utilizzando il valore unitario della massa dell isotopo più abbondante di ogni elemento (es C 5 H 12 = 72) Massa monisotopica (monisotopic mass) = la massa dello ione molecolare calcolata utilizzando il valore esatto della massa dell isotopo più abbondante di ogni elemento (es C 5 H 12 = ) Massa molecolare media (average mass) =massa calcolata utilizzando la massa media di ogni elemento (comprendendo i suoi isotopi). La massa molecolare media rappresenta il centroide della distribuzione dei picchi isotopici dello ione molecolare. (es C 5 H 12 = 72.15)

76 Masse atomiche esatte Abbr. Nome Abbondanza Massa atomica isotopica % 1 H idrogeno H deuterio H trizio C carbonio C carbonio C carbonio N azoto N azoto O ossigeno O ossigeno O ossigeno Average mass 12,011 14, ,9994

77 Linee guida per l interpretazione degli spettri EI 6. Identificare la presenza di picchi isotopici caratteristici (Cl, Br, S, Si,..)

78 Linee guida per l interpretazione degli spettri EI 4. Utilizzando le abbondanze isotopiche dedurre la composizione elementare

79 Linee guida per l interpretazione degli spettri EI 6. Identificare la presenza di picchi isotopici caratteristici (Cl, Br, S, Si,..)

80 Linee guida per l interpretazione degli spettri EI 6. Identificare la presenza di picchi isotopici caratteristici (Cl, Br, S, Si,..) 35 Cl 35 Cl 37 Cl 35 Cl 37 Cl 37 Cl

81 Linee guida per l interpretazione degli spettri EI 7. Utilizzare diverse tecniche di ionizzazione (CI, FAB, ) CI Gas reagente Metano Iso-butano Ammoniaca

82 Linee guida per l interpretazione degli spettri EI 9. Ricorre a derivati per la conferma della struttura

83 Linee guida per l interpretazione degli spettri EI 11.Segnare gli ioni a elettroni dispari importanti (serie caratteristiche, )

84 Linee guida per l interpretazione degli spettri EI

85 Linee guida per l interpretazione degli spettri EI 13. Confronto con dati presenti in banche dati o con prodotti puri

86 Linee guida per l interpretazione degli spettri EI 13. Confronto con dati presenti in banche dati o con prodotti puri

87 Linee guida per l interpretazione degli spettri EI 13. Confronto con dati presenti in banche dati o con prodotti puri