S P E T T R O S C O P I A. Dispense di Chimica Fisica per Biotecnologie Dr.ssa Rosa Terracciano

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Marilena Ferretti
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1 S P E T T R O S C O P I A

2 SPETTROSCOPIA II PARTE Spettroscopia IR Spettroscopia NMR Spettrometria di massa

3 SPETTROSCOPIA INFRAROSSA Le radiazioni infrarosse non hanno sufficiente energia da eccitare gli elettroni su livelli più alti, ma possono indurre transizioni tra livelli di energia vibrazionale e rotazionale. m 1 m 2 Un legame chimico tra due atomi può essere considerato come un semplice oscillatore armonico.

4 SPETTROSCOPIA INFRAROSSA H O H H O H O C O stiramento piegamento Atomi differenti hanno masse differenti. piegamento Legami chimici differenti hanno energie di legame differenti. I legami interatomici si allungano e si accorciano continuamente (stretching o stiramento) e si piegano gli uni verso gli altri (bending o piegamento). Gli atomi legati con un legame covalente hanno determinati valori i di energia vibrazionale: l eccitazione di una molecola da un livello vibrazionale ad un altro avviene solo quando il composto assorbe una radiazione IR di determinata frequenza: l energia è quantizzata.

5 SPETTROSCOPIA INFRAROSSA La spettroscopia IR è in pratica una tecnica analitica molto semplice. Normalmente si prepara un film in una placca di cloruro di sodio oppure si frantuma il materiale insieme al bromuro di potassio, KBr, facendone una pastiglia. Questi sali vengono utilizzati perché sono invisibili per la luce IR. Nella spettroscopia IR è consuetudine registrare la luce trasmessa e non quella assorbita da un valore 0 a un valore 100%.

6 Un tipico spettro infrarosso trasmittanza (%) Frequenza (cm -1 )

7 SPETTROSCOPIA NMR La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare è la tecnica che fornisce la maggior quantità di informazioni strutturali rispetto alle altre tecniche (IR, UV, MS) nell identificazione di un composto organico. Dallo spettro NMR di un composto ricaviamo infatti la natura degli atomi, il loro intorno chimico e il loro rapporto quantitativo. E possibile inoltre, conducendo esperimenti più sofisticati, risalire alla conformazione anche di molecole molto complesse.

8 SPETTROSCOPIA NMR La risonanza magnetica è un fenomeno completamente differente dalla teoria della risonanza. Tutti i nuclei hanno una massa e una carica. Quelli che hanno il numero di massa oppure il numero atomico, o entrambi dispari, posseggono un momento angolare ossia uno spin. Qualunque nucleo che possegga uno spin può essere studiato con l NMR. Il nucleo dell idrogeno 1 H è quello che fornisce il maggior numero di informazioni, mentre l isotopo più comune del del carbonio 12 C non compare nello spettro NMR perché non ha uno spin nucleare.

9 SPETTROSCOPIA NMR Come funziona uno spettrometro NMR? Quando un composto contenente idrogeno è introdotto in un forte campo magnetico ed è irradiato con una radiazione elettromagnetica, i nuclei di idrogeno assorbono energia. Naturalmente, come tutti i fenomeni che avvengono su scala atomica, anche questo assorbimento è quantizzato e si verifica solo quando la forza del campo magnetico e la frequenza della radiazione non raggiungono determinati valori. Gli spettrometri NMR sono in grado di misurare tale assorbimento. Uno spettrometro è costituito da un magnete molto potente ed è in grado di generare un campo di radiofrequenze mediante il passaggio di corrente elettrica in una bobina avvolta intorno al campione.

10 Come funziona uno spettrometro NMR? Per ottenere lo spettro NMR si colloca il campione all interno dello strumento e lo si irradia con energia elettromagnetica di frequenza costante: la grandezza che varia è l intensità del campo magnetico. Quando il campo magnetico raggiunge l intensità appropriata, i nuclei entrano in risonanza (cioè assorbono energia). Questo fenomeno genera una debole corrente elettrica che viene amplificata e trasformata in un segnale su di un foglio di carta calibrata. Uno spettro NMR è dato dalla registrazione del voltaggio indotto in funzione della variazione del campo magnetico. L area sotto il picco dipende dal numero totale di nuclei che hanno compiuto il salto.

11 SPETTROSCOPIA NMR NMR (nuclear magnetic resonance) Tubicino NMR contenente il campione Oscillatore a radiofrequenza Amplificatore Registratore del segnale Magnete

12 SPETTROMETRIA DI MASSA E un metodo fisico per l indagine strutturale di molecole organiche e biologiche. Questa disciplina si avvale di una serie di tecniche che permettono: 1) la determinazione del peso molecolare dei composti 2) la determinazione della loro struttura 3) la misura quantitativa delle molecole anche in presenza di miscele molto complesse (fluidi bilogici, tessuti, ecc ) Tutto questo può essere effettuato con quantità di campione estremamente limitate (fino a grammi) l analisi è di tipo distruttivo ed il campione utilizzato non può essere recuperato dopo la misura.

13 LA SPETTROMETRIA DI MASSA IN CAMPO BIOLOGICO Identifica la struttura di biomolecole: proteine, carboidrati, acidi nucleici, steroidi. Stabilisce la sequenza di biopolimeri come proteine e oligosaccaridi. Studia il metabolismo dei farmaci. APPLICAZIONI DIAGNOSTICHE Omocisteina (marcatore metabolismo metionina, malattie cardivascolari) Emoglobina (glicata, marcatore diabete, anemia falciforme) Acido Omovanilinico e Acido Vanilmandelico (marcatori oncologici, metaboliti catecolammine) Acido Metilmalonico (Acidemia metil-malonica) Acidi biliari (acido colico, acido chedeoxicolico, disfuzioni epato-biliari)

14 LO SPETTROMETRO DI MASSA Misura il rapporto massa/carica delle molecole dopo che queste sono state ionizzate, cioè dopo che gli è stata impartita una carica elettrica. Unità di misura Massa = Dalton (Da): 1 da è 1/12 della massa di un atomo di carbonio-12 ( 12 C). Carica = intesa come carica elementare di un elettrone (negativa) o di un protone (positiva) z m/z Ioni monocarica z = 1 Ioni multicarica z > 1

15 Principio di funzionamento Produzione di ioni Separazione degli ioni in base al rapporto massa/carica (m/z). Rivelazione

16 e - 2e - + massa

17 Abbondanza relativa di elementi comuni Elemento Isotopo Abbond. Isotopo Abbond. Isotopo Abbond. relativa relativa relativa Carbonio 12 C C Idrogeno 1 H H Azoto 14 N N 0.38 Ossigeno 16 O O O 0.2 Zolfo 32 S S S 4.4 Cloro 35 Cl Cl 32.5 Bromo 79 Br Br 98.0

18 Massa monoisotopica rappresenta la massa della specie molecolare isotopica più abbondante in natura. Massa media rappresenta la media tra tutte le specie isotopiche presenti nella molecola Massa nominale 128 (strumenti a bassa risoluzione: quadrupolo) Massa accurata strumenti ad alta risoluzione (TOF, Settori magnetici) Glutammina Lisina

19 Rappresentazione schematica di uno spettrometro di massa Sorgente ionica Separazione ioni Analizzatore Alto vuoto (10-6 Torr) Rivelazione ioni Rivelatore Sistema di introduzione del campione Elaborazione dati Sistema di elaborazione Dati in uscita

24 UNO SPETTROMETRO DI MASSA

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