Ionizzazione electrospray (ESI)

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1 Ionizzazione electrospray (ESI) Campione in fase liquida Analizzatore e - - Il potenziale applicato alla fine dell ago e e sufficientemente alto da nebulizzare la soluzione in una miriade di goccioline cariche,, contenenti il campione

2 Quando il solvente evapora, la concentrazione di carica alla superficie della gocciolina aumenta fino a superare la tensione superficiale causando una esplosione coulombica. Si formano così ioni dell analita privi di solvente Evaporazione Esplosione coulombica 6 Le e cariche sono statisticamente distribuite tra i siti disponibili dell analita analita,, portando spesso alla formazione di ioni a cariche multiple.

3 Determinazione della massa molecolare con ESI m 1 = M n X n m 2 = M (n - 1) X (n - 1) n = m 2 -X m 2 -m 1 M = n (m 1 X) m 1 e m 2 M n X (m/z) delle specie ioniche che si formano Peso molecolare dell analita Numero di cariche Carica

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5 Spettro ESI della Neurotensina Spettro di massa deconvoluto

6 ESI ElectroSpray Ionisation Ioni a carica multipla diminuisce m/z L analisi viene solitamente fatta con spettrometri a quadrupolo o trappola ionica ESI si adatta all interfacciamento con HPLC e CE (Capillary Electrophoresis). Sensibilita ed Estensione di Dimensioni Molecolari un po minori rispetto alla tecnica MALDI.

7 ESI (LC-MS) Separazione e analisi di una proteina dopo proteolisi, tramite abbinamento di HPLC a fase inversa e spettrometria di massa

8 Quadrupole Mass Analyzers Sono piu piccoli, piu leggeri e meno costosi dei sistemi a settore. Di solito pero hanno una risoluzione minore ( 2000) e possono rilevare m/z solo fino a 4000.

9 Tensioni continue Radiofrequenza Provocano un moto complicato degli ioni Solo alcune traiettorie sono stabili permettendo agli ioni di massa specifica di essere trasmessi al detector

10 IN TRAP

11 Analizzatore a trappola ionica Elettrodi superiore ed inferiore Elettrodo ad anello

12 Gli ioni vengono delimitati e mantenuti in moto costante nello spazio definito dagli elettrodi Detector Elettrodi superiore ed inferiore Elettrodo ad anello Gli ioni descrivono particolari orbite (figure di Lisajous) Variando le condizioni del campo elettrico si permette a ioni di massa progressivamente maggiore di essere espulsi in successione dalla trappola SRGENTE

13 ESI Sample should not contain: Salts (such as NaCl, K2HP4, etc.) decrease electrospray signal, form adducts complicating spectra Buffers (TRIS, MES, MPS) same reason as salts Reducing agents (BME, DTT) Stabilizers (glycerol, PEG) overwhelm spectra, difficult to rinse Detergents includes ionic (SDS) and non-ionic (Triton X-100) avoid during sample preparation, difficult to get rid of decrease electrospray signal

14 Vantaggi: ELECTRSPRAY Buono per composti carichi, polari o basici. Massima accuratezza nelle misure Permette l analisi di composti ad elevata massa con rapporti massa/carica che sono facilmente determinati mediante la maggior parte degli spettrometri di massa (m/z minore di ). Possibilità di controllare eventuali processi di frammentazione. Compatibile con tecniche MS/MS e LC/MS. Limiti: Specie a carica multipla richiedono algoritmi complessi per l analisi dei dati Estremamente sensibile alla presenza di contaminanti (sali, metalli, composti basici,..). Hardware relativamente complesso in confronto ad altre sorgenti ioniche. Range di massa: generalmente minore di 200,000 Da

15 Spettrometro di massa a triplo quadrupolo

16 ANALISI MS/MS: Determinazione della sequenza amminoacidica mediante CID (Collision Induced Dissociation) I peptidi vengono preferenzialmente frammentati a livello dei legami peptidici Il processo di frammentazione è solitamente una reazione unimolecolare La rottura del legame peptidico è mediata dalla protonazione Il processo di frammentazione inizia solitamente con un attacco nucleofilo a centri elettrofili Le interazioni che determinano la formazione di anelli a 5 componenti sono favorite

17 Formazione di ioni b e y Ioni Y: dal C all N terminale R 1 Y ion 3 R 2 Y ion 2 R 3 Y ion 1 R 4 NH 2 C H C N H C H C N H C H C N H C H C H b 1 ion b ion 2 b ion 3 Ioni b: dall N al C terminale

18 FRMAZINE DEGLI INI Y H H Protonazione dell N ammidico Protonazione dell carbonilico Trasferimento H oxazolone ione Y

19 FRMAZINE DEGLI INI b Protonazione dell N ammidico Protonazione dell carbonilico Ioni b Ione acylium xazolone protonato Peptide N-terminale

20 Formazione di ioni a e ioni immonio R 1 R 3 NH 2 R 1 NH R 2 protonated oxazolone N H R 3 b type ion NH 2 NH 2 R 1 NH NH C R 2 R 3 NH NH C R 2 acylium ion NH 2 R 1 H N R 2 N H R 3 NH 2 R 1 N H R 2 NH 2 R 3 a type ion C H transfer NH 2 b type ion R 1 N R 2 NH 3 R 3 immonium ion

21 Frammentazione di peptidi mediante CID Sono sempre prevalenti ioni della serie y e b Gli ioni b possono perdere C (-28 Da), formando ioni a Residui di Cys, Ser, Thr, Glu possono perdere H 2 (-18 Da) Residui di Gln, Asn, Lys, Arg possono perdere NH 3 (-17 Da) A bassiintervallidi m/zsipossonoosservareioniimmonio formatisi da singoli amminoacidi liberati La Met, se ossidata, può perdere CH 3 SH (-64 Da) Residui di fosfo-ser e fosfo-thr possono perdere P 4 H 3 (-98 Da) La rottura di legami Pro-Xxx èimpedita In condizioni particolari si possono produrre serie interne di ioni aggiuntive. La rottura di alcuni legami può essere favorita rispetto ad altri

22 Perché è così difficile interpretare gli spettri MS/MS? - I frammenti b e y si presentano contemporaneamente sullo spettro e non sappiamo riconoscere a priori se un frammento appartiene alla serie b o alla serie y - Le serie b e y possono presentarsi incomplete - Il peptide può contenere modificazioni inattese, che alterano la massa degli amminoacidi e quindi dei frammenti - I frammenti b e y, pur essendo generati in proporzione predominante, non sono gli unici frammenti che vengono generati dagli eventi di collisione - La misura delle masse relative ai vari frammenti è affetta da errore sperimentale - Un rumore di fondo non interpretabile viene generato in ogni analisi sperimentale

23 100 Sequenziamento de novo di un peptide y y 18 2 y 17 y 15 y 14 y 13 y 12 y 11 y 10 y 9 y 8 y 7 y 6 y 5 y 4 y 3 (Y,D)-T-A-A-S-K-L-E-E-A-S-K-A-A-D-E-S-E-R b 8 b 9 b 10 b 11 b 12 b 13 b 14 b 15 b 16 b 17 b 18 b 19 y Relative abundance 50 y y y y 15 2 y y b b y y 9 b y y y b b y y b b y b b y y b b y b b m/z

24 Post-Source Source-Decay (PSD) per analisi di sequenza di peptidi Il peptide è analizzato in reflectron mode Il peptide è analizzato per più di volte, ogni volta riducendo il reflectron voltage del 5-10%

25 Il PSD avviene nel tubo di volo: Laser Reflector detector Linear detector sorgente Il decadimento può avvenire in qualsiasi punto dell analizzatore Reflector

26 Grafico dell Energia Interna degli ioni precursore N ioni Energia Interna Solo una piccola frazione degli ioni precursore ha abbastanza energia per frammentarsi!

27 FNDAMENTI DEL PSD 1. PSD è un metodo per identificare e misurare le masse degli ioni frammento che si formano da uno ione precursore selezionato durante il tempo di volo 2. Gli ioni frammento si formano principalmente per decomposizione unimolecolare degli ioni precursore, già accelerati all interno dell analizzatore (ovvero dopo l uscita dalla sorgente post source decay ) 3. Gli ioni frammento sono separati nel REFLECTR

28 Inconvenienti del PSD Frammentazione poco efficiente dello ione precursore Gli spettri completi sono di difficile interpretazione La selezione dello ione precursore può essere fatta solo su picchi isolati I tempi di acquisizione sono lunghi in quanto per ottenere lo spettro completo è necessario modificare via via il voltaggio del Reflector; in linea teorica, per lo stesso motivo, cambiano anche i parametri di calibrazione Il PSD è un metodo valido per il controllo di una sequenza conosciuta