Corso di Biochimica Applicata 2012

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1 Corso di Biochimica Applicata 2012 Laboratorio di Proteomica La proteomica è una tecnica biochimica molto complessa (tanto che in alcuni Paesi è considerata una disciplina scientifica) che studia il proteoma ossia il complesso delle proteine di un organismo o tessuto, e mira a quantificare ed identificare le proteine associate con uno stato fisiologico e/o confrontare uno stato fisiologico o patologico, rispetto ad un controllo (proteomica comparativa). Permette di correlare il livello di proteine prodotte da una cellula o tessuto e l inizio o la progressione di uno stato di stress. La proteomica assieme alla genomica, ricoprono un ruolo fondamentale nella ricerca biomedica e in futuro permetterà di avere sufficienti dati per interpretare l evolversi di patologie o stati di stress di un organismo valutando molecole specifiche (biomarcatori proteici o genomici). Ci si soffermerà sulle tecniche di separazione delle proteine (elettroforesi bidimensionale e cromatografia liquida ad alta pressione) e sulla spettrometria di massa che permette di misurare la massa delle molecole che possiedono una carica. Sarà affrontato il problema di come identificare una proteina, il sequenziamento dei peptidi di una proteina partendo da uno o più spettri di massa e l identificazione delle proteine tramite la ricerca in una banca dati. Metodi di separazione delle proteine. Gel elettroforesi bidimensionale (2-DE) In proteomica si riescono a separare e visualizzare centinaia di proteine in un singolo gel, grazie alla tecnica della elettroforesi bidimensionale (2-DE) o gel bidimensionale. La tecnica, si basa sulla separazione delle proteine di un campione (colture cellulari o campioni di tessuti) in due dimensioni ortogonali. Nel caso dell'elettroforesi bidimensionale, le proprietà più utilizzate sono il punto isoelettrico (pi valore di ph al quale le proteine hanno carica netta pari a zero) e il peso molecolare (PM o MW). Una proteina immersa in un gradiente di ph e sottoposta ad un campo elettrico migrerà fino a raggiungere il punto di ph in cui la sua carica sarà pari a zero (punto isoelettrico). Quindi, le proteine con punto isoelettrico uguale si focalizzeranno in una posizione nel gradiente di ph. Questa separazione si ottiene mettendo il campione su strisce ricoperte di gel di poliacrilammide in cui è stato creato un gradiente di ph grazie alla sintesi di miscele eterogenee di derivati di acrilammide aventi la formula generale CH 2 =CH- CO-NH-R dove R contiene sia gruppi carbossilici che amminici (IMMOBILINE). La copolimerizzazione di questi monomeri con diverso pka e in diversa concentrazione, con l acrilammide, permette di creare dei gradienti preformati di ph all'interno dello spessore del gel. In queste condizioni è possibile applicare grosse differenze di potenziale su gel molto sottili e ottenere risoluzioni nell'ordine di 0,001 unità di ph. immobilina 1

2 Dopo averla equilibrata in un apposito tampone, la striscia viene posta su un altro gel di poliacrilammide e sottoposta ad un campo elettrico che permette di separare le proteine, già parzialmente separate, in una seconda dimensione. Le proteine migreranno più velocemente nel gel tanto più è piccolo il loro peso molecolare. Siccome è difficile che due proteine differenti abbiano esattamente lo stesso pi e PM si ottiene una separazione (focalizzazione) delle diverse proteine presenti nel campione. Una volta colorate si potranno osservare delle macchie, in teoria ognuna formata da una diversa proteina. Quantitativamente, nei campioni per la proteomica, le singole proteine variano, da poche femtomoli (10-15 moli) rilevabili solo con le colorazioni più sensibili (argento e Sypro Ruby) fino a più di 10 picomoli (10-12 moli) che generano spot visibili anche con colorazioni meno sensibili, come il blu di Coomassie. Ad esempio: per una proteina di medie dimensioni come la sieroalbumina bovina (BSA) che pesa circa 66kDa la quantità rilevabile varia da 0.6 nanogrammi (10-9 grammi, un miliardesimo di grammo) corrispondenti a circa 10 femtomoli, fino a oltre 660 nanogrammi (0.66μg) corrispondenti a 10pmol. 2

3 Prefissi del Sistema Internazionale tralasciando quelli maggiori di 10 (in rosso i più usati in proteomica) 10 n Prefisso Simbolo Nome Equivalente decimale Moli=g/PM g=moli x PM 10 deca da Dieci deci d Decimo 0, centi C Centesimo 0, milli m Millesimo 0, micro µ Milionesimo 0, nano n Miliardesimo 0, pico p Bilionesimo 0, femto f Biliardesimo 0, atto a Trilionesimo 0, zepto z Triliardesimo 0, yocto y Quadrilionesimo 0,

4 Cromatografia liquida ad alta prestazione (o alta pressione) HPLC La cromatografia, indica un insieme di tecniche che hanno lo scopo di separare una miscela nei suoi componenti, per permetterne il riconoscimento qualitativo e quantitativo. Nata infatti, come tecnica separativa si è sviluppata in seguito anche come tecnica analitica, si basa sul fatto che i vari componenti di una miscela tendono a ripartirsi in modo diverso tra due fasi, in funzione della loro diversa affinità con ciascuna di esse. Mentre una fase rimane fissa (la fase stazionaria), ed è generalmente un solido o un gel, un'altra fase liquida o gassosa, la fase mobile, fluisce su di essa trascinando con sé in quantità maggiore i componenti della miscela che risultano più affini ad essa. L'invenzione della cromatografia viene attribuita al biochimico italo-russo Michail Cvet nel 1906, quando riuscì, con questa tecnica, a separare i pigmenti da un estratto vegetale. Fece un estratto di foglie verdi in etere di petrolio, lo depositò in testa ad una colonna di vetro riempita (impaccata) con carbonato di calcio, usando come eluente una miscela di etere di petrolio ed etanolo i vari pigmenti si separano in bande colorate, in particolare la clorofilla A e B, il carotene e la xantofilla. L inventore la chiamò cromatografia dal greco "khrômatos" (colore) e "graphía" ("scrivere"). Per il fatto che il campione era già colorato e quindi visibile. Nella cromatografia moderna ad alte prestazioni (benché i principi generali restino gli stessi) il campione da analizzare è iniettato all'inizio della colonna cromatografica dove è "spinto" da pompe (le più diffuse sono a 2 pistoni, alternative o reciprocanti) attraverso la fase stazionaria dalla fase mobile, applicando pressioni dell'ordine delle centinaia di atmosfere. Per ottenere un'elevata efficienza nella separazione è necessario che le dimensioni delle particelle della fase stazionaria siano di diametro molto ridotto (di solito hanno diametri compresi da 3 a 10µm), per questo motivo è indispensabile applicare un'elevata pressione se si vuole mantenere una ragionevole velocità di flusso dell'eluente e quindi un tempo di analisi adeguato. Ultimamente ha preso sempre più campo la strumentazione detta UPLC (ultra performance liquid chromatography) che consente di effettuare l analisi in tempi brevissimi sfruttando particelle di diametro ridottissimo (1,7µm) e pressioni elevatissime anche 600bar. Con l UPLC si ha anche una maggiore risoluzione dei picchi. 4

5 Fasi stazionarie per la separazione in HPLC Il materiale di riempimento delle colonne con particelle microporose è il più diffuso. Le particelle hanno forma irregolare o sferica ed hanno diverse porosità; sono disponibili con diametri medi che vanno da 3 a 10 μm (1,7µm in UPLC). Si utilizzano in genere con colonne tanto più corte tanto più fine è la loro granulometria: ad esempio colonne da cm con particelle di 10 μm, fino a 3-4 cm per le fasi da 3 μm. Impaccamenti normali e in fase inversa Le cromatografie di ripartizione si distinguono anche in base alla relazione che esiste fra le polarità della fase mobile e della fase stazionaria. I primi lavori fatti sulla cromatografia liquida furono portati avanti su fasi stazionarie altamente polari; la fase mobile era costituita da un solvente relativamente poco polare come l esano o l etere isopropilico. Per ragioni storiche questo tipo di cromatografia è detta cromatografia in fase normale. Nella cromatografia in fase inversa la fase stazionaria è apolare e la fase mobile è un solvente polare. Nella cromatografia a fase normale il componente meno polare (idrofobo) del campione da separare è eluito per primo ed aumentando la polarità della fase mobile diminuisce il tempo di eluizione. Al contrario nella cromatografia in fase inversa il componente più polare (idrofilo) è quello che viene eluito per primo ed un aumento della polarità della fase mobile fa aumentare il tempo di ritenzione. Più di tre quarti di tutte le separazioni eseguite in HPLC sono su colonne in fase inversa. Durante tali separazioni i gruppi, costituiti da idrocarburi a lunga catena, sono allineati paralleli gli uni agli altri e perpendicolari alla superficie delle particelle della fase stazionaria e conferiscono l aspetto delle setole di un pennello alla superficie. Le fasi mobili più usate in questo tipo di separazioni sono soluzioni acquose contenenti solventi come metanolo, acetonitrile o tetraidrofurano in varie concentrazioni. Scelta della fase mobile e della fase stazionaria Il successo di una cromatografia di ripartizione richiede un adeguato bilancio fra le forze intermolecolari dei partecipanti al processo di separazione: l analita, la fase mobile e la fase stazionaria. Queste forze intermolecolari sono descritte qualitativamente in termini di polarità relativa fra ognuno dei tre componenti. In generale, le polarità dei comuni gruppi funzionali aumentano in questo senso: olefine < alogeno derivati < solfuri < eteri < nitro-composti < esteri ~ aldeidi ~ chetoni < alcoli ~ ammine < solfuri < solfossidi < ammidi < acidi carbossilici < acqua. Come regola generale la maggior parte delle separazioni cromatografiche sono eseguite facendo coincidere la polarità dell analita con quella della fase stazionaria (es. proteine C4 o C8, peptidi e piccole molecole organiche C18, ecc.); sono poi usati, come eluenti, solventi a polarità differenti. Si possono effettuare analisi con eluente sempre uguale (separazione ISOCRATICA) oppure miscele di eluenti, acquoso e solvente organico in proporzioni che cambiano durante l analisi dove aumenta sempre più la percentuale di solvente organico e quindi la forza eluente (separazione IN GRADIENTE). Cromatografia a scambio ionico Nella cromatografia a scambio ionico la fase stazionaria è costituita da macromolecole contenenti dei siti attivi ionizzati, in cui i controioni (ioni legati ai siti attivi della colonna) possono essere scambiati con altri aventi carica uguale, eluiti con la fase mobile. Si instaura così una sorta di competizione fra i controioni della fase stazionaria e quelli della miscela in fase di separazione, nei confronti dei siti attivi ionizzati della fase stazionaria. Durante la separazione gli analiti vengono separati gli uni dagli altri in base alla diversa affinità per ciascuno dei siti ionizzati della fase stazionaria. 5

6 Come nella normale cromatografia, si ha una colonna cromatografica impaccata con uno speciale tipo di resina, in grado di scambiare ioni. Esistono due tipi di resine: scambiatrici anioniche e scambiatrici cationiche. Le anioniche possiedono gruppi carichi positivamente (legano anioni). Le cationiche possiedono gruppi carichi negativamente e attraggono, quindi, molecole cariche positivamente. Esempio classico di gruppo in grado di scambiare cationi è -SO - 3, mentre un tipico gruppo che scambia anioni è il gruppo -NH + 4. Molto importante, ai fini di determinare l'intensità dell'interazione fase fissa-analita, è il rapporto carica/massa: utilizzando infatti il modello elettrostatico è possibile spiegare i diversi tempi di ritenzione, essendo le specie ioniche con maggior rapporto carica/massa quelle a essere maggiormente trattenute. Ad esempio Na + (massa 22, una carica) eluisce prima rispetto a Fe 3+ (massa 55, 3 cariche) Fe 3+ eluisce dopo Fe 2+ perché ha più cariche. Molti scambiatori ionici sono costituiti da polimeri di stirene e di divinilbenzene (polistirene). Il polistirene essendo un polimero lineare è solubile in numerosi solventi. Condensando invece stirene con divinilbenzene si ottengono polimeri con legami crociati e quindi insolubili: più è alto il numero di legami crociati maggiore sarà la capacità di trattenere composti ad alto peso molecolare. Rilevatori in HPLC Alla fine della colonna è applicato un rilevatore (IR, UV-VIS, spettrofluorimetro, spettrometro di massa, rifrattometri, rivelatori elettrochimici, ecc.) e un calcolatore che permettono una analisi in continuo dell'uscita della colonna e quindi di poter quantificare e/o identificare le sostanze iniettate, è possibile rilevare sostanze che assorbono nel visibile nell ultravioletto e più raramente nell infrarosso. Nel caso dello spettrometro di massa non si rilevano più le caratteristiche di assorbimento nello spettro elettromagnetico ma la massa delle molecole del campione. Un cenno meritano i rivelatori a serie di diodi (PDA photo diode array). Sono rivelatori ultravioletto che a differenza dei comuni rievatori UV-VIS consentono una registrazione simultanea dello spettro, in funzione della lunghezza d'onda, piuttosto che eseguire delle scansioni, utilizzando una serie di diodi. In questo modo si possono ottenere dei grafici tridimensionali in funzione dell'assorbanza, della lunghezza d'onda e del tempo, oppure mappe di assorbanza (tempo contro lunghezza d'onda), oltre ai classici spettri UV e cromatogrammi. Spettro elettromagnetico I vantaggi principali dell HPLC rispetto all LC sono: il diametro ridotto della colonna che evita problemi di deviazioni longitudinali e di percorsi alternativi (maggiore risoluzione dei picchi); velocità di eluizione costante e regolabile; tempi 6

7 di analisi ridotti; piccole quantità di campione necessari per l analisi (5-10 microgrammi di campione solubilizzato in apposito solvente). Una particolare strumentazione per HPLC è la nanohplc che si basa sugli stessi principi dell HPLC ma utilizza flussi di solvente ridottissimi (2-300nL/min) permettendo di accoppiare direttamente lo strumento con lo spettrometro di massa. Metodi di identificazione delle proteine. Il metodo più utilizzato, fino agli anni 80, per identificare una proteina è stato la degradazione di Edman che si basa su una reazione dell aminoacido N-terminale della proteina con fenilisotiocianato (PITC) in condizioni alcaline. Il risultante aminoacido feniltiocarbamil derivato è idrolizzato (cioè staccato dalla proteina) in acido anidro. La reazione di idrolisi porta alla formazione di una forma anilinotiazolinone dell'aminoacido (ATZ-aminoacido), liberando l'estremità amminica del peptide. Gli ATZ-aminoacidi sono solubili in solventi organici, come l'acetato di etile, possono essere separati dalla proteina che è insolubile. L'ATZ-aminoacido è convertito a feniltioidantoin derivato, in una reazione separata. Fig. 1 Reazioni che portano al feniltioidantoin aminoacido I feniltioidantoin-aminoacidi sono più stabili e possono essere separati in HPLC in fase inversa (RP-HPLC) e identificati, confrontando il tempo di eluizione con quello di uno standard. 7

8 Fig. 2 il quadro A indica il profilo HPLC di uno standard composto dalla miscela dei 20AA (10pmoli ognuno). I cromatogrammi in B, C e D sono i primi 3 cicli di degradazione di 10pmol di un peptide. Come si nota in B eluisce Leucina (L) in C Isoleucina (I) e Valina (V) in D. L intera sequenza di reazioni può essere ripetuta fino a ottenere la sequenza del peptide (al massimo 20-30AA). Attualmente esistono sequenziatori di proteine automatizzati, che partendo da 1pmol di proteina consentono di ottenere una sequenza di 20-30AA. I limiti della degradazione di Edman sono: 1) Se l amino terminale del peptide o della proteina è bloccato, come spesso avviene con la chimica usata per i gel bidimensionali, non si ottiene alcuna informazione. 2) Richiede almeno 1 picomole di proteina o di peptide puro. 3) Al massimo si può ottenere la sequenza di aminoacidi. 4) E un metodo lento. Si possono sequenziare al massimo 2 proteine al giorno (45minuti ogni ciclo di reazioni). I punti di forza della degradazione di Edman sono: 1) Si applica alla proteina intatta, all N-terminale, non richiede elaborazione per assegnare la posizione della sequenza ottenuta. 2) Si possono identificare gli aminoacidi con la stessa composizione atomica (stessa massa), leucina e isoleucina. 3) I dati sono facili da interpretare. 4) Si possono identificare con precisione gli aminoacidi fosforilati. Spettrometria di massa La spettrometria di massa è una tecnica analitica utile per l identificazione di sostanze sconosciute sia all'analisi in tracce di sostanze. Il principio su cui si basa è la possibilità di separare una miscela di ioni in funzione del loro rapporto massa/carica (m/z) generalmente tramite campi elettrici e magnetici, statici o oscillanti. La presenza della carica, positiva o negativa è un presupposto essenziale per analizzare le molecole nello spettrometro di massa, altrimenti non sarebbero soggette ai campi elettrici o magnetici presenti negli analizzatori. 8

9 E stata proposta una nuova unità di misura per la m/z, il Thomson (Th), però non accettata dallo IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry). Non è misurata direttamente la massa della molecola, la cui unità di misura è l unità di massa atomica (uma) detta anche dalton (Da), definita come la dodicesima parte della massa di un atomo di carbonio-12 ( 12 C). La spettrometria di massa è spesso usata in combinazione con tecniche separative, quali la gascromatografia allora si parla di gas massa, che separa molecole già in fase gassosa (poco usata in proteomica) e la cromatografia in fase liquida (HPLC) definita liquido-massa. Fig. 3 Diagramma a blocchi di uno spettrometro di massa. La parte in cui si muovono gli ioni è sotto vuoto. Lo strumento è gestito da un sistema di controllo. I dati acquisiti e i parametri dell analisi sono registrati dal sistema di gestione dei dati. Sistemi di ionizzazione (ion sources) Per generare gli ioni, in fase gassosa, nella liquido-massa è necessaria un opportuna sorgente. Le prime tecniche di ionizzazione delle molecole erano troppo energetiche (ionizzazione chimica ed elettronica) non erano compatibili con l analisi di grosse molecole biologiche, perché le frammentavano. Inoltre, gli ioni si generano solo se già in fase gassosa, rendendola incompatibile con campioni disciolti in liquido come di solito sono i campioni biologici. Il primo metodo che consentì di ottenere una sequenza di un peptide fu il Fast Atom Bombardment (FAB) a differenza dei metodi precedenti per la prima volta divenne possibile generare gli ioni direttamente in soluzione liquida. La vera svolta avvenne con l introduzione di metodi di ionizzazione delicati quali il MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) e l ESI (Electron Spray Ionization). Con questi metodi di ionizzazione è stato possibile applicare la spettrometria di massa in campo biomedico per l analisi di grosse molecole organiche (proteine, peptidi, zuccheri, DNA, lipidi, ecc.). 9

10 Fig 4 A. Schema della ionizzazione MALDI. Il laser colpisce i Fig 4 B. Schema generale del processo di ionizzazione cristalli della matrice di acido organico trasferendo l energia electrospray. Le goccioline cariche che escono dall ago necessaria al campione da ionizzare. tenuto ad una tensione di circa +2kV, rapidamente evaporano e si formano gli ioni che entrano nello spettrometro. Nella tecnica MALDI assume grande importanza la preparazione del campione, che non deve contenere contaminanti al di sopra di certi limiti. Inoltre, il campione liquido deve essere opportunamente miscelato e lasciato cristallizzare in una matrice (solitamente un acido organico). La caratteristica della matrice è quella di assorbire l energia dei raggi UV del laser (laser a vapori d azoto, lunghezza d onda 337nm) e coadiuvare il processo di distacco e protonazione del campione. La matrice più usata per l analisi dei peptidi triptici è l acido alfa ciano idrossicinnamico. Altre matrici usate in MALDI sono l acido diidrossibenzoico per l analisi di peptidi contenenti zuccheri, e l acido sinapinico per l analisi di molecole più grandi e proteine intere. Analizzatori di massa (mass analyzers) Una volta generati gli ioni bisogna poterli selezionare, separare e indirizzare verso il rivelatore (detector). Tutti gli analizzatori sono mantenuti in condizioni di alto vuoto, grazie a pompe che aspirano l aria all interno dello strumento. Questo consente di ottenere uno spettro con buona risoluzione, in quanto l'analizzatore dello spettrometro di massa separa gli ioni in base alla quantità di moto, le molecole molecole di gas atmosferico colliderebbero con gli ioni, variandone l'energia cinetica, peggiorando il rapporto segnale/rumore di fondo e la risoluzione. 10

11 Tempo di volo (Time Of Flight TOF) Fig 5. Schema di uno spettrometro MALDI-TOF. Il principio operativo si basa sulla ionizzazione del campione con un laser si forma una nuvola di ioni a cui si impartisce una data energia cinetica grazie all applicazione di un alto voltaggio (20-30kV). Dopo l accelerazione gli ioni entrano in una regione senza campo elettrico e in alto vuoto (10-8 mmhg) dove viaggiano ad una velocità inversamente proporzionale alla loro massa su carica (m/z). Ioni con minore valore di m/z viaggiano più velocemente di ioni con alto valore di m/z. In altre parole, ioni con massa minore e più cariche viaggiano più veloci, a parità di massa uno ione con 2 cariche viaggerà 2 volte più veloce. Misurando il tempo impiegato a percorrere il tubo di volo si può risalire al valore di m/z. Per un analizzatore di lunghezza nota si ha che il tempo di volo (t), cioè il tempo impiegato da uno ione per percorrere l'intero spazio dell'analizzatore e giungere al rivelatore è: in cui k è una costante tipica dello strumento. Il valore di t è generalmente dell'ordine di pochi microsecondi (5 20μs). Se gli ioni entrassero nell'analizzatore a tempo di volo in continuazione sarebbe impossibile ottenere una loro separazione. La miscela di ioni deve essere suddivisa in una serie pacchetti generati da brevissimi impulsi del laser e accelerati nel tubo di volo ad intervalli di tempo. Infatti, generalmente il TOF si accoppia con la sorgente MALDI che produce pacchetti discreti di ioni. 11

12 Per le sue caratteristiche il TOF permette di analizzare gli ioni in un ampio intervallo di m/z da poche centinaia fino a oltre Da. Il limite è che aumentando la massa delle molecole si ha minore sensibilità, risoluzione e accuratezza. Uno dei limiti maggiori del MALDI-TOF è la limitata risoluzione dovuta alla differente energia cinetica che acquisiscono gli ioni durante il processo di vaporizzazione e ionizzazione che porta ad una perdita di risoluzione. Per limitare il fenomeno sono stati introdotti dei miglioramenti tecnici: 1) Delayed extraction (ritardo prima dell accelerazione) permette agli ioni di uniformare la loro velocità prima di essere accelerati nel TOF. 2) Reflectron è un campo elettrico che inverte la direzione degli ioni quando raggiungono la fine del tubo di volo. Gli ioni con maggiore energia cinetica iniziale penetrano maggiormente nel campo elettrico prima di invertire la direzione, rispetto a quelli con minore energia cinetica ma con stessa m/z. L effetto finale è quello di focalizzare gli ioni con stessa m/z aumentando la risoluzione. Inoltre, il reflectron, aumenta la lunghezza del tubo di volo aumentando ulteriormente la risoluzione. Un percorso maggiore riduce ulteriormente l effetto iniziale dovuto alla differenza di energia cinetica. -Quadrupolo Fig. 6 rappresentazione schematica di un quadrupolo E il primo analizzatore ad essere stato impiegato di routine negli spettrometri di massa. Un quadrupolo è composto di quattro barre parallele di metallo. Ciascuna coppia di barre opposte è connessa elettricamente e una tensione a radio frequenza (rf) è applicata tra un paio di barre e l'altro. Una tensione a corrente continua (dc) è sovrapposta alla tensione a rf. Gli ioni possedendo la carica sono soggetti al campo elettrico e si spostano tra le barre del quadrupolo. Si possono far passare tutti gli ioni usando solo la rf, oppure si possono selezionare solamente gli ioni di un certo rapporto m/z (SIM single ion monitoring) impostando un certo rapporto delle due tensioni: gli altri ioni entrano in oscillazione instabile e urtano contro le barre. Oppure si può ottenere lo spettro in un dato intervallo di masse (scan mode) tramite una variazione dell ampiezza dei valori rf e dc (rampa) tenendo costante il loro rapporto. 12

13 Una campo elettrico con componenti di radio frequenza e corrente continua è applicata alle due coppie di barre secondo le formule: -(U+(V cos ωt)) +(U+(V cos ωt)) Dove U è la grandezza della componente dc, V è l ampiezza e ωt è la frequenza della componente rf. L analizzatore a quadrupolo si adatta bene alla sorgente di tipo elettrospray che produce ioni in modo continuo. Si registrano gli ioni che arrivano al rilevatore per un certo periodo di tempo fino ad ottenere un segnale. -Trappola ionica Fig. 7 rappresentazione schematica di una trappola ionica Può essere considerata una variante dell'analizzatore a quadrupolo. Infatti, anziché permettere agli ioni di attraversare il campo quadrupolare, la trappola ionica trattiene tutti gli ioni al suo interno. Questa variante dell'analizzatore a quadrupolo e costituito di tre elettrodi (un elettrodo anulare posto fra due elettrodi semisferici di entrata e uscita) per intrappolare ed accumulare gli ioni in una cavità di volume ristretto, la cosiddetta trappola ionica (ion trap), si ottiene così un elevata sensibilità. I due elettrodi laterali hanno un piccolo foro al centro attraverso il quale passano gli ioni. Lo spettro di massa è generato variando il potenziale elettrico in modo da espellere gli ioni verso il rivelatore secondo un valore m/z crescente e registrando il segnale degli ioni che escono dalla trappola per ogni valore. Anche questo analizzatore è, generalmente, accoppiato alla sorgente elettrospray. Rivelatori Si tratta generalmente di dinodi, cioè moltiplicatori elettronici capaci di amplificare la debolissima corrente prodotta dagli ioni che hanno superato l'analizzatore e collidono con il rilevatore. I segnali ottenuti in questo modo sono trasmessi ad un calcolatore in grado, con l'opportuno software, di rappresentare l'abbondanza di ogni ione in funzione della sua massa, cioè lo spettro di massa finale. 13

14 Segnale elettrico al computer. Cenni per l interpretazione degli spettri di massa. Il diagramma che riporta l'abbondanza relativa di ogni ione in funzione del rapporto massa/carica è il cosiddetto spettro di massa. Comprende valori che corrispondono a tutto ciò che entra nello spettrometro e possiede una massa e una carica compresa nell intervallo considerato. Nella figura i picchi corrispondono a tutti gli ioni positivi, con m/z compresa tra 700 e 2500 che sono entrati nello strumento (analita e contaminanti). Fig. 8 Spettro di massa (MALDI TOF) di un digerito triptico di BSA. 14

15 In applicazioni di routine, gli spettri sono rappresentati come istogrammi che riportano l'abbondanza di ogni ione in funzione del valore m/z. Le abbondanze sono riportate rispetto al picco base, che è il picco più abbondante osservato nello spettro. Tale normalizzazione permette di avere spettri che sono funzione solamente dell'analita e delle condizioni di analisi. Per quanto riguarda le analisi di proteine, non sempre i picchi osservati coincidono con la massa teorica dei peptidi che compongono la proteina. Infatti, per quanto detto in precedenza tutto ciò che ha una massa e possiede una carica sarà rilevato dallo spettrometro (contaminanti). Spesso si trovano picchi che a prima vista non è facile assegnare ad un peptide derivante dalla proteine. In questi casi, peraltro molto frequenti, oltre alla possibilità di aver introdotto contaminanti nel campione, ci possono essere delle modifiche negli aminoacidi che compongono il peptide, frammentazione degli ioni indotte durante l analisi, ecc. Effetti isotopici Gli isotopi (lett. nello stesso luogo) sono atomi dello stesso elemento chimico, e quindi con lo stesso numero atomico, ma con differente numero di massa, e quindi massa atomica. La differenza delle masse è dovuta a un diverso numero di neutroni presenti nel nucleo dell'atomo. Se 2 nuclei contengono lo stesso numero di protoni, ma un numero differente di neutroni, i due nuclei avranno lo stesso comportamento chimico (con delle minime differenze nei tempi di reazione e nell'energia di legame), ma avranno comportamenti fisici differenti, essendo uno più pesante dell'altro. Il numero di picchi osservati in uno spettro di massa è sempre maggiore di quello che ci aspettiamo, anche perché ogni picco è accompagnato da picchi satelliti, prodotti da ioni contenenti isotopi dei vari elementi. Dato che i rapporti medi tra le diverse quantità di isotopi di uno stesso elemento in natura sono noti e sostanzialmente costanti, dall'abbondanza dei picchi satelliti è possibile ricavare informazioni che consentono di ipotizzare gli elementi che compongono l analita. L effetto è prodotto anche dal carbonio, il maggior costituente delle molecole organiche. Il carbonio più rappresentato in natura è il carbonio 12 ( 12 C) mentre il 13 C ha un'abbondanza in natura dell'1% circa. Quindi, ogni 100 atomi di carbonio che compongono una molecola dobbiamo aspettarci un carbonio 13 che incrementa la massa di tutta la molecola di un unità di massa. Se gli atomi di carbonio sono numerosi, statisticamente, osserveremo anche il secondo picco isotopico che è 2 unità di massa maggiore rispetto al picco monoisotopico (il picco formato da elementi tutti nella forma isotopica più leggera) e così via. 15

16 Fig. 9 Spettro di massa che evidenzia la distribuzione dei picchi isotopici del carbonio. Effetti dovuti alle cariche Le tecniche di spettrometria di massa misurano il valore della massa diviso il valore della carica. Questo è importante perché il metodo di ionizzazione MALDI nella maggior parte dei casi impartisce una sola carica allo ione, perciò basta togliere il peso del protone (H + =1uma) al valore di m/z per avere il valore della massa del campione in analisi. Le cose si complicano in sorgenti come l ESI in cui la molecola acquisisce spesso due o più cariche. Per capire se un picco di m/z è dovuto ad uno ione con 2 cariche (ione bicaricato), occorre osservare la distribuzione isotopica. Essendo misurato il rapporto massa/carica ogni massa sarà divisa per il valore della carica acquisita. Lo stesso avverrà per la massa in più dovuta all isotopo del carbonio 13 che sarà 1u/2z = 0.5m/z. Quindi, i picchi isotopici di uno ione bicaricato saranno distanziati di 0.5m/z. Ovviamente anche la misura di m/z segue la stessa regola per cui uno ione bicaricato che appare a m/z sarà in realtà originato da una molecola di Da. Secondo il calcolo generale: (m/z misurato X per la carica) - carica Per lo ione in figura 10 si avrà: (639.8x2)-2= Da Fig. 10 Spettro di massa di uno ione bicaricato con i picchi isotopici che distano 0.5m/z. Analogamente il fenomeno è osservabile per gli ioni tripli caricati e così via. 16

17 Fig. 11 Spettro di massa di uno ione triplo caricato con i picchi isotopici che distano 0.33m/z. Per ottenere misurazioni della distribuzione isotopica occorrono strumenti con un elevata risoluzione, in grado di distinguere picchi molto vicini. Se lo strumento non ha sufficiente potere risolutivo si ottengono picchi che sono la media pesata dei valori dei picchi isotopici (average mass). Fig. 12 Evidenziato in giallo il picco che si otterrebbe in uno strumento a bassa risoluzione. Parametri fondamentali in spettrometria di massa I parametri fondamentali per valutare uno spettrometro di massa e quindi la bontà di un analisi sono: a) Accuratezza è la differenza che si ottiene tra la misura effettuata e il valore reale. Questo parametro è fondamentale per conoscere la tolleranza che dobbiamo indicare ai programmi di ricerca che confrontano la massa misurata con le masse teoriche. Il valore della tolleranza ovvero dello scostamento dal valore atteso può essere espresso in Dalton, che non tiene conto della massa dell analita, oppure in ppm che, più correttamente, tiene conto della massa dell analita. Come già detto gli spettrometri sono generalmente meno accurati e risolutivi con il crescere della massa misurata. Esempio 0.1Da di errore su un picco a 1500m/z sarà sempre 0.1Da di errore anche su un picco di 60000m/z 50ppm di errore su un picco di 1500m/z = 0.075Da 50ppm di errore su un picco di 60000m/z = 3Da 17

18 b) Precisione è il parametro che indica quanto una misura è riproducibile. Ossia effettuando più misure quante quanto il valore sperimentale si scosta dalla precedente misurazione. Non è legato all accuratezza in quanto possiamo avere una grande precisione, ossia misure anche tutte perfettamente uguali ma tutte ugualmente distanti dal valore reale. c) Risoluzione è la capacità di vedere separati due picchi molto vicini. In pratica è la misura che indica quanto è stretto un picco. E definita come: Ossia il rapporto fra la massa (m) e la larghezza del picco in genere a metà della sua altezza (Δm Full Width at Half Height). Spettrometria di massa in proteomica In proteomica la spettrometria di massa è utilizzata principalmente per il riconoscimento di proteine digerite con l enzima proteolitico tripsina. Si può anche misurare la massa di una proteina intera o ricercare le modifiche post-traduzionali, spesso importanti per la regolazione di vari processi cellulari (fosforilazioni, acetilazioni, metilazioni, ecc.) che apportano una modifica nella massa dell amminoacido modificato. I moderni spettrometri di massa hanno una sensibilità che consente di analizzare, agevolmente anche meno di femtomoli di proteina digerita, quantità pienamente compatibile con quelle ottenibili anche dagli spot che si colorano meno intensamente, in un gel bidimensionale. Le proteine ottenute con le più classiche tecniche di laboratorio sono direttamente analizzabili e identificabili senza lunghe e costose analisi preparative. La spettrometria di massa consente l analisi e l identificazione anche di 100 proteine in un giorno. Questi vantaggi spiegano la rapida evoluzione e il sempre maggiore utilizzo di questa tecnica nei laboratori biomedici. 18

19 Peptide mass fingerprinting (PMF) Il PMF è una tecnica analitica per l identificazione delle proteine che si basa sui dati ottenuti dalle masse dei peptidi ottenuti per digestione con enzimi proteolitici, che tagliano le proteine in corrispondenza di specifici amminoacidi. Una proteasi come, ad esempio, la tripsina è usata per tagliare la proteina di interesse è specifica e taglia dopo gli amminoacidi arginina e lisina. La specificità di taglio consente di avere peptidi sempre uguali dalla stessa proteina, le cui masse si possono confrontare con le masse teoriche ottenute dalla sequenza della proteina se presente nelle banche dati. La massa di una proteina intera è poco informativa mentre le masse dei peptidi ottenuti da una proteina sono unici come l impronta digitale da cui il nome fingerprinting. L accuratezza dell analisi dipende dalla qualità e intensità dei picchi, l accuratezza della misura dello spettrometro e da fattori di interferenza come contaminanti e modifiche, naturali o artificiali, subite dagli aminoacidi che ne alterano la massa. Il PMF si può utilizzare solo per identificare proteine che sono state già sequenziate in precedenza o è nota la corrispondente sequenza sul DNA. In quanto l identificazione si basa sul confronto della massa dei peptidi misurati nel campione reale e le masse teoriche ottenute dalla sequenza depositata in un database. E fondamentale sapere che anche piccole differenze nella massa misurata possono portare al fallimento del riconoscimento della proteina. Infatti, il riconoscimento si basa esclusivamente sulla accurata correlazione delle masse misurate e teoriche. Anche un taglio mancato da parte dell enzima può portare ad una massa molto maggiore di quella attesa. Fortunatamente, i moderni algoritmi di ricerca prevedono la possibilità di selezionare svariate modifiche, differenti enzimi e mancati tagli (missed cleavages) degli enzimi. Siccome la massa dei peptidi non è altro che la somma delle masse degli aminoacidi che li compongono, ogni variazione subita dai singoli aminoacidi si riflette sulla massa del peptide che li contiene. Infatti, se in un peptide è presente un aminoacido fosforilato ci dobbiamo aspettare di trovarlo ad una massa di 80Da maggiore. Un comune sistema di ricerca per effettuare il PMF è Mascot ( che permette di indicare nella ricerca numerose modifiche che potrebbe aver subito il campione. Un riconoscimento in PMF avrà un punteggio più alto quanto più numerose saranno le masse identificate come appartenenti ai peptidi di una proteina e quanto minori saranno le masse non appartenenti alla proteina. Lo scarto tra valore misurato e teorico deve essere il più piccolo possibile. La percentuale di copertura della proteina, per una piccola proteina bastano poche masse per una più grande ne occorrono di più. Un valore aggiunto per assegnare correttamente una identificazione è sicuramente la corrispondenza tra la massa e il punto isoelettrico della proteina riconosciuta in Mascot e i valori stimati ottenuti dal gel bidimensionale. 19

20 Tandem Massa (massa-massa o ms 2 ) La spettrometria di massa non si limita solo a determinare la massa dei composti ma, grazie a strumenti adeguati, permette anche di analizzare più a fondo la loro composizione. Gli strumenti in grado di effettuare due o più livelli di analisi sono detti spettrometri di massa tandem perché permettono di fare due esperimenti di massa sullo stesso analita. Si possono differenziare in spettrometri che effettuano la massa tandem nel tempo o nello spazio. Nel primo caso si hanno strumenti che prima accumulano gli ioni ne determinano la m/z e poi selezionano un determinato ione, lo frammentano e misurano la m/z dei frammenti in tempi successivi, sempre all interno di un solo analizzatore. Appartengono a questa categoria le trappole ioniche e gli strumenti a trasformata di Fourier. Nel caso degli spettrometri tandem nello spazio si parla anche di strumenti ibridi in quanto sono costituiti da due o più analizzatori, un primo di selezione degli ioni e un secondo che permette di analizzare le m/z degli ioni e dei frammenti. Appartengono a questa seconda categoria i quadrupoli-tof, i TOF-TOF, i tripli quadrupoli, i quadrupoli-trasformata di Fourier. Ognuno è associato con la sorgente che più si adatta alle caratteristiche peculiari. Avremo così MALDI TOF-TOF, Esi Q-TOF, Esi tripli quadrupoli, ecc. Fig. 13 Schema di uno spettrometro di massa tandem ESI Q-TOF. 20

21 Fig.14A Trappola ionica fase di accumulo degli ioni. Fig 14B Trappola ionica fase di selezione di un determinato ione Fig 14C Trappola ionica fase di rilevamento dello ione selezionato o dei suoi frammenti se effettuiamo una massa tandem. In generale negli strumenti tandem usati in proteomica la frammentazione è indotta da collisioni in una regione dello strumento in cui la pressione è maggiore per la presenza di un gas di collisione (argon o azoto). All impatto dello ione con una molecola di gas una parte dell energia collisionale si converte in energia interna che rende instabile lo ione e lo porta a frammentarsi prima di uscire dalla camera di collisione. Il processo è noto come dissociazione attivata dalla collisione (CAD) o dissociazione indotta dalla collisione (CID). I frammenti ottenuti sono analizzati per m/z nella restante regione dello spettrometro (se tandem nello spazio) o nel tempo successivo (se tandem nel tempo). E importante in questa fase che lo ione da frammentare sia isolato dagli altri altrimenti si ottengono spettri di massa/massa misti che confonderebbero l interpretazione. Cenni sull interpretazione degli spettri di massa/massa. L analisi MS/MS consente di ottenere informazioni sia sulla m/z dei peptidi originari sia sui frammenti che li compongono. Nel sequenziamento delle proteine con la spettrometria di massa le informazioni che descrivono le sequenze di aminoacidi del peptide sono contenute nello spettro di ioni prodotto dopo la frammentazione. 21

22 Conoscendo la massa teorica degli aminoacidi e la teoria della frammentazione dei peptidi è possibile, manualmente o con programmi dedicati ricostruire, almeno in parte, la sequenza aminoacidica. Si ottengono quindi: - identificazioni più confidenti delle proteine. - Si possono identificare anche proteine in miscela. - Si possono identificare e assegnare ad un aminoacido le modifiche post traduzionali. 22

23 Esempio di frammentazione teorica di un peptide bicaricato di 717Da. Si ottengono principalmente 2 serie di ioni la serie B (o beta) che conserva intatto l N-terminale. IONI DELLA SERIE B 23

24 IONI DELLA SERIE Y Conservano intatto il C terminale, che sarà un residuo di Lisina o Arginina, se la digestione è avvenuta con tripsina. 24

25 AA Codes Mono. Structure AA Codes Mono. Structure Gly G Asp D Ala A Gln Q Ser S Lys K Pro P Glu E Val V Met M Thr T His H Cys C Phe F Leu L Arg R Ile I Tyr Y Asn N Trp W