Componenti di uno spettrometro di massa

Transcript

1 Componenti di uno spettrometro di massa Camera di ionizzazione La biomolecola da analizzare viene ionizzata (i) mediante irraggiamento laser della biomolecola stessa dispersa in una matrice cristallina (MALDI); (ii) direttamente da una soluzione, nebulizzandola in presenza di un campo elettrico (ESI). Analizzatore Gli ioni vengono separati in base al loro rapporto m/z. La separazione puo avvenire attraverso filtri di massa (quadrupoli), facendo viaggiare gli ioni in un tubo di volo (TOF), o confinandoli in trappole ioniche (IT, FTICR). Rivelatore Gli ioni vengono inviati dall analizzatore al detector, che amplifica la corrente ionica diversi ordini di grandezza, generando impulsi che compongono lo spettro di massa finale. Bio-MS lezione 2 1

2 Esempio di rivelatore: moltiplicatore di elettroni Uno ione dall analizzatore Serie di dinodi 10 6 elettroni L urto di un singolo ione proveniente dall analizzatore causa una cascata di elettroni. L impulso elettrico viene successivamente digitalizzato Bio-MS lezione 2 2

3 Analizzatori: tipologie Tempo di volo (TOF) Quadrupolo (Q, triplo quadrupolo TQ) Trappola ionica (IT, trappola lineare LT) Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance (FTICR) Orpitrap Bio-MS lezione 2 3

4 Analizzatore a tempo di volo Ionizzazione Campione E k = ½ mv 2 E el =ezu Pusher, kv Rivelatore Campo elettrico Assenza di campo elettrico Bio-MS lezione 2 4

5 Analizzatore a tempo di volo In un analizzatore a tempo di volo (TOF), gli ioni vengono separati all interno di uno spazio di 1-2 metri compreso tra la sorgente di ionizzazione ed il rivelatore, detto tubo di volo. Ioni aventi una massa elevata viaggiano nel tubo di volo con velocita ridotta, arrivando con ritardo al rivelatore rispetto a ioni piu piccoli. Bio-MS lezione 2 5

6 Analizzatore a tempo di volo: reflectron Ioni aventi identico m/z ( ) ma energia cinetica leggermente diversa vengono focalizzati dal reflectron. Risultato: la risoluzione aumenta fino a 5 volte Detector Dalla sorgente Bio-MS lezione 2 6

7 Spettrometria di massa: caratteristiche Accuratezza Risoluzione Mass range Capacita di effettuare MS/MS Velocita di scansione Bio-MS lezione 2 7

8 Accuratezza Indica quanto il valore di massa calcolato dallo spettrometro si avvicina al valore vero. L accuratezza si esprime in % o in ppm. Intensita [M+H] + = 20,900 Mr (exp) = 20,899 Mr (calc) = 20,892 accuratezza = 0.03% (o 300 ppm) m/z Bio-MS lezione 2 8

9 Accuratezza e precisione... Misura precisa ma poco accurata Misura poco precisa e poco accurata.. Centro del bersaglio: valore vero Misura poco precisa ma accurata Misura precisa ed accurata... Bio-MS lezione 2 9

10 Risoluzione R = m/z m/z = ,900 Intensita FWHM m/z = m/z Bio-MS lezione 2 10

11 Analizzatore a tempo di volo: Lin vs Ref Lineare Piu sensibile Mass range illimitato Adatto a molecole che frammentano molto facilmente (glicoproteine contenenti acido sialico) Risoluzione fino a 3000 per peptidi, fino a 600 per proteine (> 10 kda) Reflectron Alta risoluzione (fino a 15,000 per peptidi) Mass range limitato (< kda) Massa piu accurata (migliore di 50 ppm) Bio-MS lezione 2 11

12 Quadrupolo Al rivelatore + (U + (Vcos ωt)) Dalla sorgente - (U + (Vcos ωt)) Bio-MS lezione 2 12

13 Quadrupolo A dati potenziali U e V solo ioni ad un preciso m/z attraverseranno il filtro a quadrupolo m/z 100 Dalla sorgente m/z 500 Dalla sorgente Al rivelatore m/z 1500 Dalla sorgente Bio-MS lezione 2 13

14 Quadrupolo Al rivelatore Dalla sorgente Regione di stabilità I parametri a e q dipendono rispettivamente dai potenziali U e V. Entrambi, inoltre, dipendono dal rapporto m/z e dalla frequenza del campo oscillante. Bio-MS lezione 2 14

15 Quadrupolo La figura illustra tre regioni di stabilità per ioni a carica singola: m1, m2 e m3. Variando i potenziali U e V, e mantenendo il loro rapporto costante, otteniamo come effetto che solo ioni ad un preciso m/z avranno traiettorie stabili e attraverseranno il quadrupolo. Cosa succede se U=0?? Bio-MS lezione 2 15

16 Quadrupolo Tempo di scansione = 1 sec. U U/V = costante Tempo Intensita 100 m/z 1000 Bio-MS lezione 2 16

17 Quadrupolo E l analizzatore di massa piu comune. (molto utilizzato in strumenti da banco GC-MS relativamente economici). Separa gli ioni nello spazio a seconda del loro rapporto m/z. Usando il voltaggio appropriato, e possibile fare si che solo ioni con un determinato m/z attraversino il quadrupolo e raggiungano il rivelatore. Il quadrupolo può essere usato come filtro ionico: possiamo settare i potenziali in modo da fare passare solo ioni aventi un determinato m/z ad un secondo analizzatore di massa o ad una camera di collisione (vedi MS/MS) Bio-MS lezione 2 17

18 Trappola ionica Ring electrode Ion entrance Ion exit From source Trapping region To detector Octapole lens Endcap electrode Ring electrode Endcap electrode Bio-MS lezione 2 18

19 Trappola ionica Pre-scan Accumulation Scan Rf frequency Compatta Time Relativamente economica Buona sensibilita Elevata velocità di scansione. Limitata da effetti space charging (saturazione di ioni all interno della trappola) Bio-MS lezione 2 19

20 Fourier-transform ion cyclotron resonance (FTICR) Superconducting magnet FT MS Image current recording Analogamente alla IT, gli ioni sono confinati in un moto periodico. Nel caso dell FTICR, però, il moto degli ioni è reso possibile da un elevato campo magnetico RF excitation voltage Bio-MS lezione 2 20

21 Fourier-transform ion cyclotron resonance (FTICR) Intensita m/z La corrente immagine viene trasformata in spettro di massa tramite una trasformata di Fourier. La corrente immagine puo essere misurata con grande accuratezza, quindi, anche m/z sara misurato con grande accuratezza. Risoluzione (1,000,000) e sensibilita (centinaia di molecole visualizzabili in un singolo spettro) elevate. Bio-MS lezione 2 21

22 Orbitrap Analizzatore più recente. Può essere visto come un ibrido tra trappola ionica e FTICR: gli ioni sono intrappolati solo grazie ad un campo elettrico. Il loro rapporto m/z è rilevato dalla trasformata di Fourier della corrente immagine generata dal moto degli ioni stessi (come nell FTICR). Elevata risoluzione (500,000). Bio-MS lezione 2 22

23 Spettrometro MALDI-TOF Ionizzazione MALDI TOF Rivelatore Laser Segnale amplificato Piastra metallica Intensita Tempo (m/z) Bio-MS lezione 2 23

24 MALDI vs ESI Impulso laser MALDI: sorgente pulsata di ioni ESI: sorgente continua di ioni Bio-MS lezione 2 24

25 Spettrometro ESI-TOF La ionizzazione MALDI e pulsata (con la frequenza del laser), percio si presta bene per essere accoppiata ad un analizzatore TOF. ESI e una sorgente continua di ioni. L accoppiamento ESI-TOF richiede una speciale geometria che unisca la sorgente continua di ioni con un analisi TOF di tipo pulsato (geometria ortogonale). Bio-MS lezione 2 25

26 ESI-QqTOF analizzatore ibrido ESI pusher rivelatore Quadrupolo Quadrupolo 100 Intensita 0 m/z 1000 Bio-MS lezione 2 26

27 Spettrometria di massa in tandem La ionizzazione per EI produce frammentazione degli ioni molecolari. Tali frammenti sono essenziali per ricavare informazioni strutturali sulle molecole analizzate. Al contrario, le tecniche di ionizzazione soft (MALDI, ESI, APCI) non producono frammentazione molecolare. Per ottenere informazioni strutturali sulle biomolecole ionizzate, risulta quindi necessario effettuare MS/MS (spettrometria di massa in tandem). Bio-MS lezione 2 27

28 Spettrometria di massa in tandem (MS/MS) La spettrometria di massa in tandem consiste nell effettuare una doppia analisi di massa su un determinato campione. Per fare cio, e possibile utilizzare due analizzatori in serie, o utilizzare lo stesso analizzatore a tempi diversi. MS1: spettro MS da 0 a 1000 m/z MS2: MS/MS su m/z Intensita Selezione del picco Intensita m/z m/z 1000 Bio-MS lezione 2 28

29 MS/MS su QqTOF Da ESI pusher Rivelatore 100 Q0: selezione Q1: Camera di collisione Relative intensity (%) m/z Full scan MS 1000 Relative intensity (%) MS/MS su 0 m/z 1000 Bio-MS lezione 2 29

30 MS/MS su triplo quadrupolo (QQQ) Q1 Q2 Q3 frammentazione frammenti Permette esperimenti di MS/MS. In modalita SRM (selected reaction monitoring) fornisce sensibilita elevatissime. SRM = uno ione di interesse viene selezionato in continuo in Q1 (il filtro lascia sempre passare solo quello specifico ione), frammentato in Q2, ed uno o piu frammenti specifici vengono filtrati da Q3 e mandati al detector. Bio-MS lezione 2 30

31 Mass range E l intervallo entro il quale lo spettrometro puo calcolare un rapporto m/z. Quadrupoli Q-TOF 50-60,000 TOF 50-1,000,000 FTICR Orbitrap Bio-MS lezione 2 31

32 Accuratezza Quadrupoli TOF Q/TOF ppm 20 ppm (peptidi) ppm (proteine) 20 ppm FTICR Orbitrap 1-2 ppm 2-5 ppm Bio-MS lezione 2 32

33 Risoluzione Quadrupoli TOF Q/TOF (peptidi) 1000 (proteine) FTICR Orbitrap Bio-MS lezione 2 33

34 Spettrometria di massa in tandem (MS/MS) Singolo quadrupolo TOF NO NO Triplo quadrupolo Trappole (IT, LT, FTICR) Ibridi (LT/FTMS, TOF/TOF, Q/TOF) SI SI SI Bio-MS lezione 2 34