TRASFORMAZIONE GENETICA DI SPINACIO (SPINACIA OLERACEA L.) MEDIATA DA AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

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Leopoldo Ferri
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1 LABORATORIO DI BIOTECNOLOGIE VEGETALI (Prof. Alma Balestrazzi) TRASFORMAZIONE GENETICA DI SPINACIO (SPINACIA OLERACEA L.) MEDIATA DA AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

2 CHE COSA SONO LE PIANTE TRANSGENICHE? Le piante transgeniche sono prodotte con la tecnica del DNA ricombinante Con questa tecnica è possibile introdurre nuovi geni che consentono alla pianta di migliorare le proprie caratteristiche

Esempio di OGM vegetale (pianta transgenica) dotato di resistenza a insetti dannosi ottenuto mediante inserimento del gene Bt foglie di arachide

4 Esempio di OGM vegetale (pianta transgenica) dotato di resistenza a insetti dannosi ottenuto mediante inserimento del gene Bt foglie di arachide divorate da larve dell insetto dannoso foglie di arachide che producono un pesticida naturale in grado di proteggerle dalle larve

5 Agrobacterium tumefaciens: un sistema di ingegneria genetica frutto dell evoluzione

6 Agrobacterium tumefaciens: un sistema di ingegneria genetica frutto dell evoluzione INOCULAZIONE ESEMPIO DI TUMORE (GALLA) Agrobacterium tumefaciens GALLA indotta in vitro

TRASFORMAZIONE GENETICA DI CELLULE DI MESOFILLO FOGLIARE DI SPINACIO http://www.slowfood.it/ IL NOSTRO TARGET http://www.ortofruttabaldan.

7 TRASFORMAZIONE GENETICA DI CELLULE DI MESOFILLO FOGLIARE DI SPINACIO IL NOSTRO TARGET CELLULE DI MESOFILLO FOGLIARE MESOFILLO FOGLIARE (TESSUTO) CLOROPLASTI

8 TRASFORMAZIONE GENETICA DI CELLULE DI MESOFILLO FOGLIARE DI SPINACIO 1 I NOSTRI STRUMENTI (TOOLS) TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE ENZIMA DI RESTRIZIONE TAGLIO DNA LIGASI SALDATURA

9 TRASFORMAZIONE GENETICA DI CELLULE DI MESOFILLO FOGLIARE DI SPINACIO I NOSTRI STRUMENTI (TOOLS) 2 VETTORE (PLASMIDE) GENE DI INTERESSE PLASMIDE RICOMBINANTE

10 TRASFORMAZIONE GENETICA DI CELLULE DI MESOFILLO FOGLIARE DI SPINACIO I NOSTRI STRUMENTI (TOOLS) Coltura in vitro di cellule vegetali microcallo callo rigenerazione

11 TRASFORMAZIONE GENETICA DI CELLULE DI MESOFILLO FOGLIARE DI SPINACIO PLASMIDE RICOMBINANTE GIA PREDISPOSTO RISULTATO??? ESERCITAZIONE trasformazione genetica mediata da Agrobacterium tumefaciens

12 STEP 1: STERILIZZAZIONE TESSUTO FOGLIARE trasferire foglie in contenitore sterile (tipo Magenta) versare 200 ml di Etanolo al 70% incubare per 3 min a temperatura ambiente forte agente sterilizzante, estremamente fitotossico al termine eliminare l etanolo e versare 200 ml di soluzione contenente teepol (0.04%) e ipoclorito di sodio (10%) incubare per min a temperatura ambiente ipoclorito di sodio: efficace per sterilizzazione di superficie - teepol: detergente universale, rimuove particelle estranee al termine eliminare la soluzione ed effettuare 3-4 lavaggi con dh 2 O sterile per eliminare ogni residuo di agente sterilizzante.

13 STEP 2: preparazione degli espianti (leaf discs) e co-coltivazione con il ceppo ingegnerizzato di Agrobacterium tumefaciens Tutte le operazioni devono essere effettuate con estrema cura per non danneggiare il tessuto fogliare Prelevare una foglia sterilizzata con la pinzetta e trasferirla in una piastra Petri Con l aiuto di un bisturi excidere porzioni di tessuto di forma quadrata (1 cm x 1 cm, approssimativamente) (espianti o dischetti fogliari) e trasferire gli espianti in una piatra Petri contenente la sospensione di cellule di Agrobacterium tumefaciens (ceppo ingegnerizzato con il gene nptii) e incubare per min al termine asciugare bene gli espianti su carta bibula sterile per eliminare l eccesso di sospensione batterica trasferire gli espianti su piastre NUTRICI, incubare per min

14 CHE COSA SONO LE PIASTRE NUTRICI? le cellule del tessuto fogliare sono state sottoposte a stress meccanico durante la preparazione degli espianti e sono state poi esposte all inoculazione con Agrobacterium tumefaciens per favorire la ripresa della proliferazione, gli espianti sono trasferiti su piastre nutrici costituite da terreno mescolato con cellule vegetali in sospensione le colture cellulari in attiva proliferazione riversano nel mezzo composti che stimolano la riattivazione del ciclo cellulare cellule vegetali in proliferazione inglobate in terreno a formare le piastre nutrici forniscono questo supporto agli espianti di spinacio

15 CHE COSA SONO LE PIASTRE NUTRICI? TERRENO MS cellule in sospensione di pioppo (Populus spp.) PIASTRA NUTRICE (recovery)

16 STEP 3: gli espianti co-coltivati sono trasferiti su terreno selettivo gli espianti sono infine trasferiti su piastre Petri contenenti un substrato nutritivo (TERRENO MS) costituito da sali (macronutrienti, micronutrienti) e vitamine (es, piridossina, tiamina), saccarosio (fonte di carbonio organico) il terreno contiene l antibiotico kanamicina come agente selettivo questo antibiotico è citotossico e uccide le cellule vegetali che non sono state trasformate da Agrobacterium tumefaciens le cellule che sono state trasformate (frequenza di trasformazione = 1 cellula ogni 10 6 ) esprimono il gene nptii che codifica per l enzima neomicina fosfotransferasi in grado di detossificare la molecola di kanamicina gli espianti sono mantenuti a C per 4-5 settimane in attesa di verificare la comparsa di calli e/o tessuto da cui sarà possibile rigenerare in vitro la pianta geneticamente modificata

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