Genetica batterica (Mappe genetiche in batteri)

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1 Genetica batterica (Mappe genetiche in batteri)

2 Trasformazione - Trasferimento unidirezionale di DNA extracellulare all interno delle cellule - Osservata per la prima volta nel 1928 da Griffith e 1944 da Avery - Il DNA estratto dal ceppo donatore e frammentato e utilizzato per trasformare le cellule (riceventi) - I trasformanti sono identificati solo quando il donatore ed il ricevente differiscono per alcuni marcatori genetici - Si distinguono trasformazione naturale (Bacillus subtilis) e ingegnerizzata (E. coli)

3 Trasformazione in Bacillus subtilis 1 a+ 2 a a a+ 4 3 a a+ a a+ 5 Trasformante a+

4 MAPPATURA MEDIANTE TRASFORMAZIONE FREQUENZA DI CO-TRASFORMAZIONE (quale e la percentuale di batteri che portano assieme due marcatori: NUMERO DI COTRASFROMANTI (a,b)/totale - MAGGIORE E LA FRAQUENZA DI CO-TRASFORMAZIONE MINORE E LA DISTANZA TRA DUE MARCATORI

5 Esercizio sulla trasformazione In un esperimento di trasformazione, il DNA donatore di un ceppo a+b+ e stato utilizzato per trasformare un ceppo ricevente di genotipo ab. Sono state isolate le classi trasformanti ed e stata determinata la loro frequenza: a+b+, 307 a+b, 215 ab+, 278 Il numero totale dei trasformanti e 800. Qual e la frequenza con cui il locus b e cotrsformato con il locus a? numero cotrasformanti a+b+ numero totale trasformanti per a+ x /522 * 100 = 58.8% - MAGGIORE E LA FRAQUENZA DI CO-TRASFORMAZIONE MINORE E LA DISTANZA TRA DUE MARCATORI Considerando anche il marcatore c (rispetto a b) ed avendo trovato una frequenza di cotrasformazione pari al 32%, cio indicherebbe d(a-b) < d(b-c)

6 Trasduzione - Processo nel quale i batteriofagi (virus batterici) trasferiscono l informazione del DNA batterico da un batterio (donatore) ad un altro (ricevente); questi fagi sono chiamati fagi vettori - Il virus puo seguire un ciclo litico (duplica il suo DNA nella cellula batterica e la rompe per propagare se stesso) o un ciclo lisogeno (si integra nel DNA della cellula ospite e li rimane sino all inizio di un ciclo litico). - I fagi che possono dare ciclo litico e lisogenico sono definiti temperati La trasduzione si distingue in specializzata e generalizzata: 1. Specializzata se il DNA fagico integrandosi in un punto specifico del DNA tasferisce solo determinati geni; 2. Generalizzata il fago trasferisce casulamente i geni del batterio

7 Trasduzione Batteriofago

8 Ciclo litico e trasduzione Fago trasducente

9 Ciclo lisogenico CICLO LITICO CICLO LITICO INDUZIONE CICLO LITICO EXCISSIONE 5. Numerose divisioni cellulari INTERGRAZIONE

10 MAPPATURA MEDIANTE TRASDUZIONE FREQUENZA DI CO-TRASDUZIONE (quale e la percentuale di batteri che portano assieme due marcatori: NUMERO DI COTRASDUTTANTI (a,b)/totale - MAGGIORE E LA FRAQUENZA DI CO-TRASDUZIONE MINORE E LA DISTANZA TRA DUE MARCATORI

11 Esercizio sulla trasduzione In un esperimento di trasduzione, il donatore era c + d + e + ed il ricevente era cde. La selezione e stata fatta per c +. Le 4 classi di trasduttanti ottenute in questo esperimento sono: Classe Composizione genetica Numero 1 c + d + e c + d + e 76 3 c + d e c + d e + 2 Detrminare la frequenza di cotrasduzione per c+ e d+ Detrminare la frequenza di cotrasduzione per c+ ed e+ Quale delle frequenze di cotrasduzione calcolate rappresenta la distanza maggiore? numero cotrasduttanti c+d+ numero totale trasduttanti per c+ x100 f.co.(c-d) = 133/500x100 = 26.6% f.co.(c-d) = 59/500x100 = 11.8% d(c-e) > d(c-d)

12 Esercizi

13 Esercizi

14 Esercizi

15 Tubo di Davis Coniugazione nei batteri Saggiato su piatre per la ricerca di prototrofi ASSENZA DI PROTOTROFI Ceppo A Ceppo B Setto poroso Non permette il passaggio dei batteri

16 Coniugazione nei batteri

17 Coniugazione nei batteri - Processo di trasferimento unidirezionale attraverso il diretto contatto tra una cellula batterica donatrice (F+) ed una ricevente (F-) - Si forma un pilo a seguito del contatto cellulare attraverso il quale passa il plasmide batterico, plasmide F F+ F- F+ F- F+ F+ I due batteri (F+ ed F-) diventano entrambi F+

18 Coniugazione nei batteri - Per ottenere da coniugazione la ricombinazione dei geni cromosomici sono necessari particolari ceppi derivati da ceppi F+, chiamati Hfr (High frequency of recombination) F+ F+ Hfr Batterio F+ Evento ricombinativo un solo crossing over Plasmide F integrato

19 Coniugazione nei batteri - Il ceppo Hfr puo ricombinare con ceppi F- e trasferire a questi il DNA del plasmide F con parte del DNA del batterio - Il DNA entrato puo ricombinare con il DNA del batterio F- ed in questo modo trasferire geni del batterio Hfr al batterio F-, che comunque rimarra F-

20 Coniugazione nei batteri Hfr F- Hfr F- Hfr F- Hfr F- 1. L origine di trasferimento si replica sull Hfr 2. Il doppio crossing over in F- incorpora in DNA dell Hfr nel DNA cromosomico del batterio F-

21 Coniugazione nei batteri - Il plasmide puo excidere dall Hfr ed in tal modo puo riportare al batterio F+ di partenza (da cui si e originato) oppure l episoma F (portante geni del cromosoma batterico) ad alta capacita di trasferimento genico Hfr a nb. osserva il destino del gene a F+ F a a

22 E possibile definire le mappe orarie

23 Costruzione delle mappe orarie

24 Esercizio sulla coniugazione Con la tecnica dell incrocio interrotto sono stati analizzati 4 ceppi Hfr per la sequenza con la quale trasmettevano un certo numero di geni a un ceppo F-. Ciascun ceppo Hfr trasmetteva i suoi geni in una sequenza particolare, mostrata nella tabella qui sotto(nella tabella sono riportati solo i primi sei geni trasmessi per ciascun ceppo). Ordine Ceppo 1 Ceppo 2 Ceppo 3 Ceppo 4 primo O R E O F H M G B M H X A E R C E A C R ultimo M B X H Qual e la sequenza dei geni nel ceppo originario dal quale derivano i ceppi Hfr? Indicare in una figura l origine e la polarita del trasferimento per ciascuno dei 4 ceppi.

25 Università di Bari Esercizio sulla coniugazione Sono stati condotti esperimenti di coniugazione interrotta su tre ceppi di un batterio E. coli Hfr su batteri F-. I risultati sono riportati qui di seguito: Ceppo 1 lac+ 3 min gal+ 12 min his+ 39 min argg+ 63 min xyl+ 74 min ilv+ 78 min thr+ 95 min Ceppo 2 argg+ 19 min xyl+ 30 min ilv+ 34 min thr+ 51 min lac+ 59 min gal+ 68 min his+ 95 min Ceppo 3 ilv+ 5 min xyl+ 9 min argg+ 20 min his+ 44 min gal+ 71 min lac+ 80 min thr+ 88 min Qual è la mappa di questi marcatori e la loro distanza in minuti?