Evoluzione del concetto di gene II. La complementazione

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1 Evoluzione del concetto di gene II La complementazione

2 Un gene = un polipeptide Definizione scarsamente operativa perché in un organismo complesso non è possibile corrrelare ogni segmento di DNA con uno specifico polipeptide tra i tanti prodotti. Meglio utilizzare un approccio genetico piuttosto che biochimico Test di complementazione introdotto da Ed Lewis e rielanorato da S. Benzer per definire sperimentalmente il concetto di gene nel fago T4

3 Per verificare se due mutazioni sono a carico dello stesso gene (e quindi sono alleliche) o se sono a carico di geni diversi si usa il test di complementazione o test cis-trans o test di allelismo

4 Mappatura del genoma fagico

5 Fenotipi fagici placche di lisi e specificità d ospite (ceppo batterico che un fago è in grado di lisare)

6 Marcatori del fago T2: h+ lisa il ceppo B di coli ma non il ceppob/2 ceppo B h lisa sia il ceppo B che il B/2 r+ placche piccole con margini indistinti r placche grandi con margini netti quando fagi h+ crescono su uno strato misto di cellule B e B/2 formano placche torbide perchè lisano solo B e i batteri B2 crescono nelle placche provocando torbidità delle placche. I fagi h formano invece placche chiare

7 Il lisato si piastra su una miscela di ceppi B e B/2

8 Frequenza di ricombinazione tra h ed r = placche (h+ r + ) + (h r ) placche totali x 100

9 Come di effettua il test di complementazione nei fagi?

10 Esempio: test di complementazione tra mutazioni del gene rii del fago T4 I fagi mutanti rii producono placche grandi con margini netti ; sono in grado di lisare il ceppo B di E.coli ma non il ceppo K(λ). I fagi selvatici rii+ producono placche piccole con margini irregolari; sono in grado di lisare sia il ceppo B di E.coli che il ceppo K(λ). Per fare il test di complementazione tra due fagi mutanti rii (es. rii 1 e rii 2 ) si fa una doppia infezione (o infezione mista) su K(λ) e si verifica se avviene la lisi oppure no. I fagi dei due ceppi mutanti vengono piastrati ad alta molteplicità di infezione cioè ad un concentrazione elevata in modo che i batteri vengono infettati contemporamenamente da entrambi i tipi di mutanti

11 Se si ha la lisi delle cellule K(λ) vuol dire che le mutazioni sono a carico di geni diversi e pertanto complementano. Se non si osserva lisi le mutazioni sono a carico dello stesso gene e di conseguenza non complementano

12 Un gene o cistrone è la regione genetica all interno della quale non c è complementazione tra mutazioni Il cistrone è l unità di funzione

13 Il cistrone prende il nome dal test di complementazione che si chiama test cis-trans m1 trans + m1 cis m2 + m2 + + complementazione m1 trans + m2 + assenza di complementazione complementazione cis m1 + m2 + + complementazione

14 Test di complementazione in Drosophila

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16 Nei batteri il test si effettua costruendo diploidi parziali stabili mediante sesduzione

17 Mediante il test di complementazione è possibile definire il gene come unità di funzione

18 La struttura fine del gene

19 Benzer (negli anni 50 ) utilizzò un sistema molto sensibile per mettere in evidenza la ricombinazione intragenica (il fago T4) e costruì una mappa genetica dettagliata di siti all interno del gene rii La sensibilità del sistema era data dal fatto che i fagi producono progenie molto numerosa pertanto era possibile mettere in evidenza eventi di ricombinazione rari come quelli che si potrebbero verificare all interno di un gene

20 Che differenza c è tra complementazione e ricombinazione? Nella complementazione i genotipi della progenie fagica rimangono mutanti come quelli dei genitori. Avviene solo un mescolamento di prodotti genici o Nella ricombinazione i genotipi della progenie sono diversi da quelli dei genitori riia riib riia riib

21 Analisi genetica della progenie fagica La progenie fagica si piastra su Complementazione E.coli B tutti i fagi formano placche (titolo elevato) E.coli K(λ) non si osserva formazione di placche Ricombinazione tutti i fagi formano placche (titolo molto basso) formano placche la metà dei fagi (i selvatici) che lisano B. I doppi mutanti non formano placche

22 Benzer isolò circa 3000 mutanti rii e li saggiò a coppie per vedere se erano allelici o no K(λ) B rii assenza di lisi placche grandi margini netti rii + placche piccole margini irregolari placche piccole margini irregolari

23 Benzer fece delle doppie infezioni nel ceppo di E. coli K(λ) Dai dati di complementazione capì che le mutazioni rii mappavano in due unità di funzione il cistrone A ed il cistrone B I mutanti del cistrone A non complementavano tra loro ma complementavano con tutti i mutanti del cistrone B. I mutanti del cistrone B non complementavano tra loro ma complementavano con tutti i mutanti del cistrone A.

24 cistrone A cistrone B rii Il numero dei mutanti assegnati a ciascun cistrone risultò più o meno lo stesso (circa 1500) Benzer fece doppie infezioni con coppie di mutanti rii (tutti appartenenti allo stesso cistrone) sul ceppo B ed il lisato fagico ottenuto lo piastrò sul ceppo K(λ) (sul quale potevano crescere solo i ricombinanti selvatici) ed ottenne ricombinanti selvatici che si erano originati da ricombinazione intragenica.

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26 I dati di Benzer confermarono che la ricombinazione può avvenire anche tra siti all interno di uno stesso gene. (Questi siti furono chiamati reconi) frequenza di ricombinazione tra due alleli = ricombinanti rii+ x 2 numero totale della progenie numero di placche presenti sul ceppo B

27 Benzer non osservò mai frequenze di ricombinazione inferiori allo 0,01% anche se il suo sistema era in grado di mettere in evidenza anche frequenze di ricombinazione dello 0,0001%. Ciò suggeriva l esistenza di un limite fisico al di sotto del quale non può avvenire ricombinazione. Successivamente si capì che il limite fisico definito dalla la più piccola unità di ricombinazione (il recone) coincideva con la singola coppia nucleotidica