Differenze tra procarioti e eucarioti

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1 GENETICA BATTERICA

2 Differenze tra procarioti e eucarioti Caratteristiche Procarioti Eucarioti Dimensioni 0,3-2μm > 5μm Organizzazione genetica Nucleo circondato da membrana Assente Presente DNA complessato agli istoni Assente Presente Numero di cromosomi Uno Più di uno DNA extracromosomiale Plasmidi Mitocondriale Geni Contigui o riuniti in operoni Discontinui Divisione per mitosi Assente Presente Citoplasma Reticolo endoplasmico Assente Presente Apparato del Golgi Assente Presente Mitocondri Assenti Presenti Lisosomi Assenti Presenti Ribosomi 70 S 80 S Membrana citoplasmatica Assenza di steroli Presenza di steroli Parete cellulare Formata Se presente, da peptidoglicano formata da polisaccaridi

3 Vantaggi dello studio dei batteri nell analisi genetica facile e rapida coltivazione poco dispendioso e possibilità di seguire parecchie generazioni genomi hanno dimensioni ridotte rispetto a organismi superiori, ma è possibile trarre informazioni preziose, anche su organismi superiori molto più facile ottenere trasformanti, mutanti, inattivazione di funzioni, trasformazioni stabili i batteri in particolare, essendo aploidi, permettono di correlare più direttamente il genotipo con il fenotipo

4 FACILE E RAPIDA COLTIVAZIONE Contenitori per la crescita di batteri in terreno liquido (beuta e provetta) e in terreno solido (piastra Petri). Nel primo caso la crescita dei batteri si evidenzia come un intorbidimento del terreno di crescita trasparente, nel secondo si osservano colonie di batteri sulla superficie del terreno solido

5 CURVA DI CRESCITA BATTERICA trasmittanza (T): rapporto tra l intensità della luce in uscita ed intensità della luce incidente Assorbanza (A)

6 Una cellula batterica che si divide ogni 30 minuti dopo 15 ore darà origine ad un miliardo di batteri che formano una colonia o clone Ogni colonia è un clone di batteri che deriva da una singola cellula.

7 I batteri auxotrofi sono mutanti che hanno perduto la capacità di sintetizzare metaboliti (aminoacidi, basi azotate o vitamine), che quindi richiedono nel mezzo di coltura Sono anche chiamati mutanti nutrizionali o biochimici

8 Selezione di mutanti nutrizionali attraverso l utilizzo di terreni selettivi

9 replica plating ideato nel 1952 dai coniugi Lederberg

10 Il trasferimento dei cloni che crescono in terreno massimo al terreno minimo mantenendo la loro distribuzione uguale a quella che essi hanno nella piastra madre, mostra che un clone della piastra madre è un mutante auxotrofo

11 Dal momento che il mutante cresce solo in presenza di leucina, è auxotrofo per la sintesi di leucina (leu-)

12 CELLULA BATTERICA Strutture fondamentali Parete Membrana Strutture accessorie Pili Flagelli Capsula

13 Strutture esterne: Dall esterno verso l interno si possono trovare: Capsula Membrana esterna Parete cellulare Membrana plasmatica Strato di polisaccaridi protettivo spesso associato con la patogenicità perché serve come una barriera contro la fagocitosi da parte dei leucociti. Doppio strato lipidico presente solo nei Gram- Formata da peptidoglicano (polisaccaridi + peptidi), mantiene complessivamente la forma Doppio strato lipidico con diverse proteine responsabili del trasporto di ioni, nutrienti

14 PARETE BATTERICA Organizzazione diversa della parete nei Gram positivi Gram negativi

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16 Colorazione di Gram Colorazione più importante e usata in batteriologia. Prende il nome dal patologo danese che la mise a punto. Permette di distinguere i batteri in Gram+ e Gram-. Colorazione differenziale. Utilizzando differenti coloranti in tempi successivi, individua differenze strutturali della cellula batterica. Le differenze strutturali riguardano la parete cellulare. I batteri Gram+ si colorano in viola. I batteri Gram- si colorano in rosso.

17 GRAM POSITIVI: provvisti di un rivestimento polisaccaridico (parete cellulare a più strati di peptidoglicano) che permette al batterio durante la colorazione di GRAM di assumere un colore blu/violetto GRAM NEGATIVI: sono batteri che hanno una parete cellulare formata da due strati (una membrana lipidica esterna e uno strato peptidoglicano interno) e durante la colorazione di GRAM assumono un colore rosso

18 COMPOSIZIONE PARETE GRAM + Quasi la totalità della parete (90-95%) è costituita da mureina (o peptidoglicano) la quale è responsabile della rigidità della parete e del trattenimento del colorante di Gram. I componenti principali del peptidoglicano sono 1. Scheletro glicanico costituito da Acido N-acetilmuramico NAM Acido N-acetilglucosammina NAG Catene laterali peptidiche D- L- aminoacidi Acido diaminopimelico 3. Legami crociati peptidici

19 Il monomero del Peptidoglicano NAM= N-Acetil muramico NAG= N-Acetil glucosoammina, Sono degli AMMINOZUCCHERI Alle catene glicaniche è legato il tetrapeptide, catena costituita da 4 aminoacidi. Queste catene sono legate al gruppo COOH dell acido muramico tramite legame peptidico. Le catene tetrapeptidiche sono essenziali per la formazione dei legami crociati: ogni catena glicanica è legata ad altre catene glicaniche parallele, tramite legami che si formano tra i tetrapeptidi.

20 Struttura del peptidoglicano

21 Legami crociati nei Gram- Nei batteri Gram- la quantità di legami crociati è molto minore rispetto a quella dei Gram+

22 Legami crociati nei Gram+ Nei batteri Gram+ le catene peptidiche non formano legami diretti fra loro, ma sono unite tramite un ponte di pentaglicina

23 Transpeptidazione L enzima responsabile della formazione del legame crociato è la transpeptidasi. Gli antibiotici -lattamici (come la penicillina) funzionano da inibitori irreversibili delle transpeptidasi batteriche.

24 Azione di penicilline e cefalosporine Acetil-D-Ala-D-Ala-OH penicilline cefalosporine L azione degli antibiotici avviene per la somiglianza con il substrato. Il substrato specifico della transpeptidasi è il frammento D-Ala-D-Ala delle catene peptidiche del peptidoglicano in crescita. Un inibitore della transpeptidasi deve somigliare al frammento D-Ala-D-Ala

25 Funzioni della parete batterica 1. PROTEZIONE 2. FORMA SOLLECITAZIONI MECCANICHE RIGONFIAMENTO OSMOTICO 3. PROCESSO DI DIVISIONE

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27 Un altra funzione della parete è quella di dare la forma La suddivisione dei batteri può essere fatta in base alla loro forma. La forma dei batteri è una condizione Fissa Geneticamente determinata COCCHI: con forma tondeggiante Stafilococchi: a grappolo Streptococchi: lineare

28 BACILLI :forma a bastoncino

29 SPIRILLI :forma a spirale o a virgola

30 GENOMA BATTERICO Il genoma batterico (o nucleoìde) consta di due componenti: -Cromosoma (contiene i geni housekeeping, essenziali per la sopravvivenza) - Elementi extracromosomici mobili (MGEs) (contiene geni non essenziali ma accessori, responsabili del trasferimento genetico orizzontale o verticale)

31 Il cromosoma dei batteri è presente in singola copia ed è unico Generalmente circolare, super-spiralizzato Mancano gli istoni Le dimensioni del cromosoma sono variabili: Mb Le dimensioni del cromosoma sono proporzionali al livello di interazione del microrganismo con l ambiente (intracellulari obbligati 480 kbp; ambientali 6.3 Mbp) Frequente raggruppamento di geni codificanti per funzioni correlate organizzazione in operoni

32 REPLICAZIONE BIDIREZIONALE DEL CROMOSOMA BATTERICO Il processo di duplicazione ha inizio da un punto di origine posto sulla membrana citoplasmatica e termina dal lato opposto

33 Nei batteri l informazione genetica, oltre a trovarsi nel cromosoma, può essere presente su cromosomi accessori, molecole di DNA circolare a doppio filamento di dimensioni minori rispetto a quelle del DNA genomico ELEMENTI EXTRACROMOSOMICI NATURALI PLASMIDI EPISOMI

34 PLASMIDI Elementi genetici accessori: materiale genetico extra-cromosomico DNA a doppia elica, forma circolare Dimensioni: da meno di 5 kb a centinaia di Kb Possono essere presenti in centinaia di copie Capaci di replicazione indipendente

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36 FUNZIONI CONFERITE AI MICRORGANISMI DAI PLASMIDI Non sono indispensabili, ma conferiscono alla cellula batterica ospite importanti vantaggi selettivi: Produzione batteriocine Utilizzazione fonti energetiche insolite Antibiotico resistenza (fattore R) Resistenza ai metalli pesanti Induzione di tumori nelle piante Agenti di virulenza: tossine o molecole responsabili della virulenza

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38 ELEMENTI TRASPONIBILI NEI PROCARIOTI SEQUENZE DI INSERZIONE (IS) Segmenti di DNA batterico che si possono muovere da una posizione ad un altra dello stesso cromosoma o di un altro cromosoma Sono unità autonome e codificano solo per le proteine necessarie alla propria trasposizione (trasposasi) Tutti gli elementi IS iniziano e finiscono con brevi sequenze a ripetizione invertita (IR)

39 Struttura delle IS Sequenza a ripetizione invertita Sequenza a ripetizione invertita

40 Distribuzione degli elementi IS in un fattore F Essendo regioni con sequenza identica, gli IS sono potenziali siti di crossing over (per esempio è alla base dell integrazione del fattore F nel cromosoma a formare i ceppi Hfr) Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

41 I TRASPOSONI Nei batteri esistono due tipi di trasposoni: 1.I trasposoni composti Due elementi IS (con orientamento diverso) posti ai lati di un gene a formare la sequenza a ripetizione invertita (IR). La trasposasi codificata da uno dei due elementi IS è necessaria per catalizzare il movimento dell intero trasposone.

42 2. I trasposoni semplici Affiancati da sequenze IR brevi (meno di 50 bp) che non codificano per l enzima trasposasi. I trasposoni semplici stessi codificano la loro trasposasi, oltre a portare i geni batterici I TRASPOSONI SONO PIÙ LUNGHI DEGLI ELEMENTI IS E CONTENGONO ULTERIORI GENI CODIFICANTI PER PROTEINE

43 Sequenza d inserzione IR Trasposasi IR Trasposoni composti IR IR altri geni IR IR Trasposasi sequenza IS sequenza IS Trasposoni semplici IR Trasposasi altri geni IR

44 trasposone lunghezza modulo marcatori genetici (bp) terminale Tn Amp Tn Hg Tn Utilizzazione lattosio Tn IS50 Kc Tn IS1 Cm Tn IS10 Tet Tn IS1 Enterotossina stabile al calore I trasposoni furono inizialmente scoperti come elementi genetici mobili che conferiscono resistenza ai farmaci

45 L odissea evolutiva del gene ampc di Klebsiella Sotto l uso massiccio di antibiotici è stato selezionato il gene ampc che aveva acquisito due sequenze IS con il risultato di essere maggiormente trascritto conferendo un livello di resistenza clinicamente significativo promotore forte ampc IS IS Il risultante trasposone è stato capace di muovere ampc in un plasmide coniugativo, oggi diffuso a molti ceppi di Klebsiella Quello che un tempo era un gene di resistenza clinicamente irrilevante è diventato il terrore degli ospedali tutto grazie alle IS

46 Episomi Elementi genetici accessori: materiale genetico extracromosomico Capaci di replicazione indipendente Dimensioni: circa 10 5 bp Possono essere presenti in una o poche copie nel batterio Non sono indispensabili, ma possono conferire alla cellula batterica ospite importanti vantaggi selettivi Mentre i plasmidi sono solo elementi citoplasmatici gli episomi possono trovarsi nel citoplasma oppure integrati nel DNA

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48 Caratteristiche di plasmidi ed episomi. Minicromosoma Dimensioni (kb) Numero di geni Numero copie/cel lula Plasmide 3-5 <10 Fino a 100 Integrazione nel DNA genomico No Geni specifici Resistenza: antibiotici, metalli pesanti; Sintesi: antibiotici, colicine, enterotossine, ecc. Episoma ~30 < Sì Integrazione, trasferimento DNA, coniugazione Trasferimento geni!!!!!

49 Riproduzione dei batteri I batteri si riproducono per schizogonia o divisione semplice: una cellula madre cioè si divide e forma due cellule figlie perfettamente uguali tra loro, perché ciò possa avvenire è necessario che il patrimonio genetico venga egualmente ripartito, il DNA pertanto deve potersi duplicare. Questo processo assicura la corretta ripartizione del corredo genetico tra le cellule figlie.

50 Fasi della riproduzione batterica Duplicazione del cromosoma batterico: Il materiale cromosomico, ancorato alla membrana citoplasmatica, si duplica generando due nuovi cromosomi ancorati ciascuno separatamente alla membrana Accrescimento delle membrane: Si verifica l accrescimento delle membrane batteriche ed il conseguente allungamento della cellula, partendo dalla zona di membrana che separa le due strutture cromosomiche Allontanamento delle strutture cromosomiche: Continuando l accrescimento della cellula, le due strutture cromosomiche si distanziano sempre di più l una dall altra Separazione delle cellule figlie: La separazione è causata dalla formazione di un setto che parte dalla membrana e si approfonda nel citoplasma in direzione centripeta Distacco delle cellule: All interno del setto di membrana si forma un setto di parete permettendo il definitivo distacco delle cellule

51 genetica Batteri: riproduzione asessuata mediante scissione binaria, che è preceduta dalla duplicazione del DNA la conseguenza più evidente di una riproduzione asessuata consiste nell'uniformità della popolazione tutte le cellule risultano uguali fra di loro e uguali alla cellula madre in una popolazione batterica non dovremmo aspettarci nessuna variazione genetica di generazione in generazione. In realtà anche nei batteri esistono fenomeni di variabilità

52 La variabilità genetica consente una maggiore sopravvivenza alla popolazione batterica. Consiste in una modificazione del DNA e può avvenire per: Mutazione: Variazione ereditabile della sequenza di basi dell acido nucleico che costituisce il genoma dell organismo Ricombinazione genetica: Processo attraverso il quale elementi genetici, presenti in due genomi diversi, vengono a trovarsi in un unica unità genetica.

53 Esperimento di Lederberg & Tatum (1946) A. E. coli met- bio- thr+ leu+ x B. E. coli met+ bio+ thr- leu met+ bio+ thr+ leu+ exconiuganti o ricombinanti

54 Dimostrazione di Lederberg e Tatum della ricombinazione genetica tra cellule batteriche A e B non sono in grado di crescere su terreno minimo (MM) perché contengono mutazioni che determinano l incapacità di sintetizzare le sostanze necessarie per la crescita

55 Questo risultato suggeriva che doveva essere avvenuta una qualche forma di ricombinazione tra i genomi dei due diversi ceppi Si poteva supporre che le cellule dei due ceppi non si scambiavano geni ma diffondevano sostanze utilizzabili dalle altre cellule. Questa ipotesi fu scartata dagli studi di Davis col TUBO ad U

56 Il contatto fisico tra cellule è necessario affinché avvenga la ricombinazione. Le cellule non possono passare attraverso il filtro e quindi non avviene la ricombinazione Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

57 Trasferimento di materiale genetico nei batteri Il trasferimento del materiale genetico è univoco: da donatore a ricevente. I batteri riceventi possono acquisire informazioni genetiche dal DNA donatore che gli permettono di ricevere nuovi caratteri.

58 Tre meccanismi di trasferimento di DNA batterico Trasformazione : Trasferimento di materiale genetico mediante l incorporazione di una molecola di DNA extracellulare libero Coniugazione : due cellule batteriche entrano in contatto tramite una struttura detta sex pilus che permette il trasferimento di materiale genetico (plasmidi) Trasduzione (conversione fagica): il trasferimento genetico è mediato da batteriofagi, virus capaci di infettare i batteri. Può essere ristretta o generalizzata

59 CONIUGAZIONE Trasferimento di materiale genetico tra due cellule batteriche mediante contatto diretto. Il trasferimento è mediato da una struttura cellulare batterica chiamata pilo, la quale forma un ponte (o tunnel) tra la cellula donatrice e la cellula ricevente

60 In (a) il pilo tiene unite le due cellule batteriche In (b) tra le due cellule si forma un ponte-poro. Nella cellula donatrice viene prodotta una copia a filamento singolo del DNA plasmidico che passa nel ricevente dove funge da stampo per la costruzione di una doppia elica

61 IL FATTORE F La capacità da parte dei batteri di formare un pilo, e quindi di donare il materiale genetico, è conferita dalla presenza nella cellula di un plasmide definito fattore F (F indica fertilità). Il fattore F porta i geni necessari alla sintesi del pilo (oltre ai geni necessari per la sua replicazione durante la coniugazione). Batteri provvisti del fattore F vengono definiti F + e sono ceppi «donatori» Batteri sprovvisti del fattore F vengono definiti F - e sono ceppi «riceventi» Batteri F -, ricevendo durante la coniugazione il fattore F, diventano F +, ossia diventano loro stessi in grado di «donare» il plasmide ricevuto

62 13 geni - pilo F

63 Duplicazione «rolling circle» di DNA plasmidico 1. PLASMIDE CIRCOLARE 2. ROTTURA DI UNA CATENA 3. SPIAZZAMENTO DI CATENA 4. SINTESI DI DNA 5. TERMINE REPLICAZIONE, LIGAZIONE

64 1. F+ (donatore) contenente un plasmide F+ codificante per il pilo sessuale. I pili si legano alla cellula F- interagendo con una proteina di membrana presente sulla superficie della cellula F- definita OmpA 2. Formazione coppia coniugativa. Nucleasi/elicasi causa rottura in orit di una catena del plasmide F+. 3. Retrazione del pilo sessuale e formazione di un ponte intercellulare. Una catena del plasmide F+ entra in F-. 4. Sintesi della catena complementare di F+ in entrambi i batteri, adesso in grado di produrre il pilo sessuale. Nella coniugazione F+ x F- non si assiste a trasferimento di DNA cromosomico

65 Il fattore F è un EPISOMA Può integrarsi nel cromosoma batterico tramite ricombinazione (resa possibile da sequenze IS nel DNA batterico e plasmidico). Il DNA F integrato si replica con il cromosoma batterico

66 La ricombinazione sitospecifica per crossing over tra un elemento IS del fattore F e il cromosoma batterico dà origine ad un ceppo Hfr (high frequency recombination).

67 LUCA CAVALLI SFORZA SCOPRÌ UN DERIVATO DI UN CEPPO F + CON 2 SINGOLARI PROPRIETÀ 1. Incrociando con ceppi F- questo ceppo produceva ricombinanti pari a 1000 volte i ricombinanti prodotti da un normale F + e per questo lo chiamò Hfr 2. Negli incroci Hfr X F - nessuno dei genitori F - era convertito in F + o in Hfr

68 I ceppi Hfr (high frequency recombination) derivano dall integrazione del plasmide F nel cromosoma.

69 Coniugazione: Hfr x F- 1. Formazione Hfr: inserzione di un plasmide F+ nel nucleoide del batterio donatore. 2. Formazione coppia coniugativa. Rottura monocatenaria del DNA a livello del plasmide F+ integrato. 3. Retrazione pilo sex e formazione ponte intercellulare. Ingresso del DNA monocatenario nel batterio accettore. Interruzione spontanea della coniugazione: solo una parte del DNA donatore verrà trasferita all accettore. 4. Il donatore sintetizza una copia complementare del DNA rimanendo Hfr. L accettore sintetizza una catena complementare del DNA trasferito. Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

70 CONIUGAZIONE BATTERICA E RICOMBINAZIONE

71 Negli Hfr in coniugazione il trasferimento del DNA a singolo filamento inizia da un punto fisso del cromosoma detto origine (O) e prosegue in modo lineare Il punto O è il sito nel quale è inserito il plasmide F Quanto più è lontano un gene dall origine, tanto più tardi sarà trasferito nella cellula F- La rarità degli exconiuganti convertiti in Hfr suggerisce che il plasmide F inserito sia trasferito al ricevente come ultimo elemento del cromosoma lineare

72 CONIUGAZIONE INTERROTTA Vengono incrociati due ceppi batterici: Hfr (lac+ e gal+ ma str-) x F - (lac- e gal- ma str+) azi r ton r lac + gal + str s x azi s ton s lac - gal - str r Hfr F - Ad intervalli di tempi diversi viene presa un aliquota della coltura batterica e posta in un agitatore per indurre un interruzione della coniugazione. Dopo agitazione l aliquota di batteri viene piastrata su terreno contenente streptomicina e su diversi terreni per saggiare la presenza di alleli marcatori del donatore nell exconiugante. TONr (resistente al fago T1), AZIr (resistente alla sodio azide), STRs (sensibile alla streptomicina)

73 Il fattore di fertilità F si inserisce in punti e con orientamenti variabili da un ceppo Hfr di E.coli ad un altro. Tutti i ceppi hanno lo stesso ordine di geni sul cromosoma. L orientamento del fattore F determina quali geni entrano per primi nella cellula ricevente. I geni più vicini alla parte terminale entrano per ultimi.

74 La sovrapposizione delle mappe di coniugazione di diversi ceppi Hfr di un tipo batterico ci permette di ricostruire le mappe geniche del tipo batterico in esame. Inoltre, ha permesso di dedurre il cromosoma batterico essere circolare Ogni linea può essere considerata una mappa che mostra l ordine degli alleli sul cromosoma.

75 MAPPE DI ASSOCIAZIONE La mappatura basata sul tempo di ingresso non si basa sulla frequenza di ricombinazione e le unità di mappa sono minuti, non RF Tuttavia, anche nei batteri è possibile usare la frequenza di ricombinazione per ottenere mappature di maggior dettaglio La ricombinazione nei batteri non coinvolge due interi genomi ma avviene tra un genoma completo proveniente da F-, l endogenote, e da uno incompleto derivante dal donatore Hfr detto esogenote

76 SCHEMA SINTETICO DELLA CONIUGAZIONE

77 lac Accade a volte che un fattore F fuoriesca dal cromosoma tramite un crossing over tra le regioni omologhe ai lati del plasmide In alcuni casi, però, il plasmide porta via con sé una parte del cromosoma batterico. Un plasmide F che porta del DNA del genoma batterico è detto plasmide F (F primo) Ceppi di questo tipo, nell esempio in figura, diventano F + lac + ed è chiamato F

78 Caratteristiche delle cellule di E. Coli contenenti diversi tipi di fattore F Tipo cellulare Ruolo nella coniugazione Fattore F F+ F- Hfr F Donatore Ricevente Donatore ad alta frequenza Donatore Presente (DNA circolare) Assente Presente integrato Presente (DNA circolare con geni batterici)

79 Risultati della coniugazione Tipi cellulare F+ x F- F- x Hfr F x F- Dopo la coniugazione Due cellule F+ Una cellula Hfr ed una F- (se viene trasferito l intero cromosoma, evento molto raro, la cellula F- diventa F+) Due cellule F (la cellula F- diventa F )

80 Il ceppo Hfr di E.coli mostrato qui sotto è stato usato come donatore per la coniugazione con un triplo mutante (tri - pur - leu - ). Se la coniugazione viene interrotto dopo 30 minuti quale sarà il fenotipo più frequente dell ex-coniugante? leu tri a. Prototrofo b. Auxotrofico per tri, pur e leu c. Auxotrofico per pur e tri d. Auxotrofico solo per leu e. Auxotrofico solo per pur pur

81 Primi esperimenti sulla trasformazione hanno riguardato il trasferimento del carattere produzione della capsula da ceppi di Streptococcus pneumoniae capsulati e quindi dotati di virulenza a ceppi privi di capsula e perciò non patogeni.

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83 GRIFFITH, 1928 Non può essere spiegato da una mutazione Principio trasformante Che veniva trasferito alla progenie

84 Avery, McCarty e McLeod (1944) identificarono nel DNA la «sostanza trasformante»

85 TRASFORMAZIONE Assunzione di frammenti di DNA solubile dall ambiente circostante da parte di cellule batteriche competenti (Bacillus, Haemophilus, Neisseria, Pneumococcus). Influenzato da: Dimensioni DNA Sensibilità DNA a nucleasi Competenza della cellula accettrice naturale o indotta artificialmente

86 COMPETENZA La cellula ricevente, per poter essere trasformata, deve trovarsi in una particolare condizione che prende il nome di competenza Il raggiungimento di un livello soglia nella densità cellulare attiva la sintesi ed il rilascio di un fattore di competenza (Gram+) che, agendo a livello di membrana, induce: modificazioni di parete cellulare (autolisina) sintesi/attivazione di proteine (DNA-binding, nucleasi, sistema RecA) La competenza può essere: naturale (Bacillus, Streptococcus, Neisseria, Haemophilus) indotta artificialmente (P. aeruginosa, E. coli, S. typhimurium), mediante trattamento a freddo con CaCl 2 (bassa efficienza, utilizzato di routine nel clonaggio di DNA in E. coli ) oppure elettroporazione.

87 FASI DEL PROCESSO DI TRASFORMAZIONE Cellula batterica lisata rilascia frammenti di DNA; il DNA conserva potenzialità di guida a sintesi proteica Frammenti liberi si adsorbono alla superficie della cellula ricevente e attraversano la membrana cellulare

88 ComEA, EC, FA e G sono proteine della competenza

89 I frammenti di DNA vengono incorporati nel cromosoma della cellula ricevente; la proteina RecA promuove la ricombinazione omologa tra il DNA ss donatore e quello recipiente

90 Mappe di associazione con la Trasformazione Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

91 TRASDUZIONE Trasferimento di materiale genetico tra due cellule batteriche mediante batteriofagi (virus batterici) Esistono due tipi di trasduzione 1. Trasduzione generalizzata: (teoricamente) qualsiasi gene può essere trasferito 2. Trasduzione specializzata: solo specifci geni possono essere trasferiti

92 Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006 Batteriofago T4 infetta E.coli

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94 Batteriofagi litici (ciclo litico)

95 Batteriofagi temperati (ciclo lisogeno)

96 Trasduzione generalizzata Il batteriofago riconosce e Inocula il genoma nella adsorbe alla cellula batterica cellula batterica 1. Il genoma batterico si frammenta e quello del batteriofago si replica 2. Vengono assemblati nuovi batteriofagi 3. Frammenti del genoma batterico possono essere assemblati nei nuovi batteriofagi

97 1. I batteriofagi neoformati vengono liberati (lisi batterio) 2. I fagi con i frammenti del DNA del primo batterio (donatore) adsorbono ad un altro batterio (ricevente) 3. Il fago inocula il frammento di DNA del batterio donatore nel batterio ricevente 4. Il frammento di DNA del batterio donatore si integra stabilmente nel genoma del batterio ricevente

98 Trasduzione generalizzata può essere usata per ottenere informazioni sull associazione genica Geni sufficientemente vicini da essere trasdotti in un singolo frammenti Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

99 Trasduzione ristretta (fagi temperati) Il batteriofago inocula il Il genoma del batteriofago si integra nel genoma nella cellula batterica genoma della cellula batterica (profago) Quando il genoma fagico si excide può incorporare un frammento del DNA batterico Il nuovo frammento fagico replica e si formano batteriofagi veicolanti la porzione di DNA batterico

100 Il batteriofago inocula il genoma veicolante la porzione di DNA batterico donatore in un altro batterio (ricevente) Il genoma del fago, integrandosi stabilmente nel genoma dell ospite, veicola un tratto del genoma del batterio donatore

101 La trasduzione ristretta richiede una ricombinazione sito-specifica L integrasi di ( Int) catalizza la ricombinazione tra due siti specifici, noti come siti di attacco, o att. Il sito attp si trova sul DNA fagico ed il sito attb sul cromosoma batterico attp attb attl attr Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

102 Meccanismo della trasduzione specializzata. Un crossing over nello specifico sito di attacco di λ produce un batterio lisogenico Il batterio lisogenico può produrre un normale λ o raramente un λ dgal una particella di trasduzione contenente il gene gal

103 Fagi che portano i geni batterici localizzati sulla parte destra del profago, mancheranno dei geni richiesti per le funzioni lisogene (es.. Il gene int) che sono localizzati nella porzione sinistra del profago. Fagi difettivi Necessitano di fago helper

104 BATTERIOFAGI POSSONO ESSERE USATI NELL ANALISI GENETICA Si possono incrociare due fenotipi fagici diversi per misurare la ricombinazione e quindi mappare il genoma virale Un singolo fago attraverso infezioni ripetute e produzione di progenie, produce una placca (area trasparente) su un tappeto opaco di cellule batteriche Morfologia della placca e specificità ospite sono alcuni utili marcatori genetici

105 Fago T2 r - : provoca la lisi delle cellule rapidamente, producendo placche grandi Fago T2 r + : provoca lisi lenta, con placche piccole Carattere r controlla la morfologia della placca

106 Fago T2 h - : può infettare 2 ceppi diversi di E.coli, ceppo 1 e 2 (placche chiare) Fago T2 h + : può infettare solo 1 (in una cultura mista placche torbide, perche cellule del ceppo resistente continuano a crescere nella placca) Carattere h controlla la specificità dell ospite

107 Mappatura del cromosoma fagico mediante incroci Incroci tra fagi. Infezione mista Parentali h - r + x h + r - La frequenza dei ricombinanti fra questi due caratteri indica la distanza di mappa esistente tra i geni che conferiscono il carattere r ed h Ricombinanti (h + r + )+ (h - r - ) / numero totale delle placche Doppia infezione di una cellula di E.Coli Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

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109 Selezionati con ceppi K ESPERIMENTI DI BENZER PER LA MAPPATURA INTRAGENICA I mutanti del locus rii del fago T4 sono in grado di crescere sul ceppo B di E.coli (cosi come i wilde type) I mutanti rii non crescono sul ceppo K12 di E.coli Il fenotipo del mutante rii produce placche grandi con margini definiti mentre i wilde-type generano placche piccole con margini irregolari Benzer analizzò mutanti diversi del locus rii rii a - b + x a + b - genomi virali ricombinanti a + b + a - b -

110 TEST CIS-TRANS E COMPLEMENTAZIONE Benzer effettuò la co-infezione di E.coli K, in cui crescono solo fagi wilde type, con i due mutanti rii a - ed rii b - Se le due mutazioni appartengono a geni diversi, si ha complementazione Se le due mutazioni sono localizzate nello stesso gene, non c è complementazione e non si formano placche di lisi