Genetica batterica. Giovanni Di Bonaventura, PhD CI «Microbiologia e Microbiologia Clinica» CdS Medicina e Chirurgia AA

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1 Genetica batterica Giovanni Di Bonaventura, PhD CI «Microbiologia e Microbiologia Clinica» CdS Medicina e Chirurgia AA

2 Genoma batterico Il genoma batterico (o nucleoìde) consta di due componenti: - Cromosoma (contiene i geni housekeeping, essenziali per la sopravvivenza) - Elementi extracromosomici mobili (contengono geni non essenziali ma accessori: determinanti di virulenza, geni responsabili del trasferimento genetico orizzontale o verticale): plasmidi elementi trasponibili o o o sequenze di inserzione trasposoni elementi invertibili

3 Cromosoma batterico Singolo (microrganismi aploidi) DNA bicatenario e circolare (lineare in Streptomyces coelicolor e Borrelia burgdorferi) Privo di istoni «Mosaico» in natura: contiene geni di diversa provenienza, a seguito di fenomeni di trasferimento genetico orizzontale (trasferimento genico tra cellule diverse) Dimensioni variabili ( Mb; µm), proporzionali al livello di interazione del microrganismo con l ambiente intracellulari obbligati - Mycoplasma genitalium: 480 kbp; ambientali - Pseudomonas spp: 6.3 Mbp) Per poter essere contenuto nella cellula batterica, il cromosma è superavvolto. Replicazione bidirezionale, da una singola origine. Richiede despiralizzazione (DNA-girasi).

4 Cromosoma batterico Replicazione del DNA batterico Escherichia coli: cromosoma rilasciato a seguito di lisi batterica

5 Plasmidi Elementi genetici extracromosomici di piccole dimensioni (1-150 kpb), in grado di replicarsi autonomamente DNA bicatenario e circolare (lineare in Streptomyces spp) Possono trovarsi liberi nel citoplasma oppure «integrati» nel cromosoma batterico (episoma) Non confinati nel singolo ospite: possono essere trasferiti e replicati in diversi ospiti +/- strettamente correlati. Numerosità e tipologia di plasmidi in funzione della specie batterica: gruppi di compatibilità: dimensioni = 1/k n copie Qualità dell informazione genetica scarsa omologia con il cromosoma e raramente indispensabili per la sopravvivenza/moltiplicazione batterica in condizioni ottimali codificano per fattori di virulenza batterica: produzione di pili, tossine (enterotossine, emolisine), adesine, siderofori, batteriocine fattori R: determinanti dell antibiotico-resistenza Plasmidi: F (sessuali o coniugativi), F (Hfr): integrati nel cromosoma plasmidi criptici : funzionalità non nota Un batterio può perdere ( curarsi ) un plasmide, in assenza di una pressione selettiva (es. batterio con plasmide antibiotico-r cresciuto per varie generazioni in assenza di antibiotico)

6 Plasmidi

7 Elementi trasponibili Tipologia: sequenze di inserzione trasposoni elementi invertibili Caratteristica traslocazione tra elementi diversi (cromosoma, plasmidi) del genoma batterico Generalmente, la traslocazione avviene all interno della STESSA cellula (a differenza dei meccanismi di trasferimento di materiale genetico) eccezione: trasposoni coniugativi (coniugazione) Due meccanismi di trasposizione: conservativa nessuna duplicazione di elemento replicativa duplicazione di elemento La trasposizione induce un effetto mutageno : mutazione letale mutazione non letale

8 Elementi trasponibili Sequenze di Inserzione (IS) piccole dimensioni ( bp), integrazione sito-specifica mediante sequenze invertite e ripetute, core codificante solo per trasposizione (solo effetto mutageno). Trasposoni rilevanti dimensioni (> bp), integrazione sito-specifica mediante IS, core contenente uno o più geni (es. geni per farmaco-resistenza). Trasposoni coniugativi (possono essere trasferiti da una cellula all altra). Possibile fusione di diversi trasposoni

9 Elementi trasponibili Elementi invertibili oltre a geni codificatori per la trasposizione, presenza di DNA-invertasi capace di invertire l elemento di 180 (rispetto ad un asse centrale virtuale) nella sua locazione cromosomica ( variazione di fase flagellare H1/H2 in Salmonella, fase fimbriale in E. coli) Isole genomiche integrate nel cromosoma mediante fago, veicolano geni per la patogenicità (pathogenicity island) e per la vita simbiontica. Caratterizzano la patogenicità (invasività, adesività, sopravvivenza intracellulare, iron-uptake, etc.) di batteri di una stessa specie differenziandoli da batteri non patogeni.

10 Meccanismi di variabilità genetica La variabilità genetica consente al batterio una maggiore fitness, ossia la capacità di potersi adattare a differenti ambienti. I cambiamenti a carico del genoma avvengono mediante: Mutazione genica Trasferimento genico orizzontale: Coniugazione Trasformazione Trasduzione Ricombinazione genetica Conversione lisogenica Fusione del protoplasto

11 Mutazioni Mutazione = modificazione, più o meno estesa, della sequenza nucleotidica (genotipo), con possibili effetti sulle caratteristiche macroscopiche (fenotipo). Considerato il tempo di generazione medio di una cellula batterica, l effetto di una mutazione sul fenotipo si esprime in tempi brevissimi (20-30 min). Ceppo mutante vs ceppo selvaggio (wild-type, wt). Una mutazione viene selezionata se conferisce un vantaggio selettivo (es. antibiotico-r). Possono essere, talvolta, letali per la cellula. Mutazioni spontanee ( bp / generazione) insorte durante la duplicazione/riparazione del DNA, a seguito di integrazione/perdita di elementi mobili, per azione fagica. Mutazioni indotte da agenti mutageni chimici (ag. alchilanti, ac. nitrico, 5-bromouracile), fisici (raggi X, U.V.) o biologici (virus). Elevata frequenza. Reversione della mutazione: può avvenire nel sito mutato originario od in un sito differente. Annulla la mutazione ristabilendo il fenotipo originario (ceppo revertante).

12 Mutazioni microlesionali: effetti sul fenotipo Puntiformi, interessano 1 sola base: Inserzione aggiunta di una base (frameshift) Delezione perdita di una base (frameshift) Sostituzione Transizione - sostituzione tra basi puriniche/pirimidiniche. Transversione - sostituzione base pur/pirim con base pirim/pur. Effetti sul fenotipo: sequenza aa invariata per degenerazione del codice genetico - proteina funzionale (mutazioni SILENTI). sequenza aa mutata proteina incompleta, probabilmente non funzionale (mutazioni MISSENSE). produzione di un codone di STOP: arresto sintesi proteina, non funzionale (mutazioni NONSENSE).

13 Mutazioni macrolesionali: effetti sul fenotipo Interessano più basi (sequenze): Delezione - comporta l eliminazione completa di un segmento di DNA. Inserzione - introduzione di un nuovo segmento di DNA all interno di una sequenza preesistente. Duplicazione - ripetizione in tandem di un segmento di DNA. Inversione - rotazione di 180 di un segmento di DNA. Traslocazione - inserimento di un segmento di DNA in un altra posizione del genoma. Effetti sul fenotipo: inattivazione del gene interessato

14 I meccanismi di trasferimento genico consentono la mobilizzazione di sequenze di DNA (plasmidi, parte del cromosoma, trasposoni coniugativi) tra cellule differenti, appartenenti alla stessa specie od a specie differenti: Coniugazione Trasformazione Trasduzione La sequenza di DNA trasferita potrà integrarsi nel cromosoma della cellula accettrice a seguito di ricombinazione genetica.

15 Coniugazione Coniugazione = trasferimento genico unidirezionale mediato da plasmide che richiede un contatto fisico tra due cellule batteriche («donatrice» e «accettrice»). Avviene sia nei Gram+ che Gram- ma con meccanismi differenti: pilo sessuale (Gram-negativi) ferormoni (Gram-positivi) Plasmidi coniugativi: plasmidi che possono essere trasferiti tra cellule mediante coniugazione Plasmide F plasmide della fertilità (F fertility) geni rep codificano per la replicazione geni tra - codificano per il trasferimento geni mob - codificano per la mobilizzazione 4 elementi IS mediano l integrazione nell endogenote

16 Coniugazione: tipi cellulari Pilo sessuale (pilo F): codificato dal plasmide F, è una struttura superficiale prodotta da cellule F+ che riconoscendo un recettore sulla cellula F-, consente la formazione di una coppia coniugativa tra cellule F+ e F- e, in tal modo, il trasferimento del plasmide. Sulla base della presenza o meno del pilo, si riconoscono 3 tipi cellulari: Cellula F + : cellula contenente un plasmide F (cellula donatrice o maschile ) Cellula F - : cellula non contenente un plasmide F (cellula ricevente o femminile ) Cellula Hfr (high frequency of recombination): cellula contenente un plasmide F integrato nel cromosoma (cellula donatrice o maschile )

17 Coniugazione: F + x F - Nella coniugazione F + x F - non si assiste a trasferimento di DNA cromosomico

18 Coniugazione: F + x F -

19 Coniugazione: Hfr x F - Nella coniugazione Hfr x F - : viene trasferito un segmento di DNA cromosomico. Questo potrà andare incontro a: - Degradazione (nessun effetto) - Circolarizzazione (plasm. coniugativo) - Integrazione (nuovi caratteri) la cellula accettrice rimane F -

20 Coniugazione: Hfr x F -

21 Coniugazione nei Gram-positivi Enterococcus faecalis Produzione e rilascio di ferormoni da parte della cellula accettrice (femminile) I ferormoni inducono la produzione di una sostanza «aggregante» alla superficie della cellula donatrice (maschile) Formazione di aggregati cellulari con trasferimento del plasmide coniugativo

22 Coniugazione: significato Significato clinico: Principale meccanismo di trasferimento di geni per l antibiotico-resistenza Trasferimento di geni codificanti per fattori di virulenza (enterotossine, adesine, siderofori) Significato ambientale: Trasferimento della resistenza ad erbicidi, idrocarburi aromatici, metalli pesanti Trasferimento di geni per la fissazione dell azoto tra Rhizobia Significato tecnico: Coniugazione con batteri Hfr in vitro può essere interrotta in tempi diversi con trasferimento di un progressivo di geni (mappatura dei genomi batterici) Significato evoluzionistico: Principale meccanismo evolutivo/adattativo batterico

23 Trasformazione Meccanismo di trasferimento genetico evoluto da una primitiva esigenza nutrizionale Assunzione di frammenti di DNA solubile dall ambiente circostante da parte di cellule batteriche competenti (Bacillus, Haemophilus, Neisseria, Pneumococcus) Osservato sia nei Gram+ che nei Gram- Influenzato da: dimensioni DNA sensibilità DNA a nucleasi competenza della cellula accettrice (naturale od indotta artificialmente)

24 Trasformazione: scoperta Avery, McCarty e McLeod (1944) identificarono nel DNA la sostanza trasformante

25 Trasformazione: scoperta Avery, McCarty e McLeod (1944) identificarono nel DNA la sostanza trasformante

26 Trasformazione: competenza La cellula accettrice deve, per poter essere trasformata, trovarsi in una particolare condizione che prende il nome di competenza. Competenza: capacità cellulare di catturare il DNA. Il raggiungimento di un livello soglia nella densità cellulare attiva la sintesi ed il rilascio di un fattore di competenza (Gram+) che, agendo a livello di membrana, induce: modificazioni di parete cellulare (autolisina) sintesi/attivazione di proteine (DNA-binding, nucleasi, sistema RecA) La competenza può essere: naturale (Bacillus, Streptococcus, Neisseria, Haemophilus) indotta artificialmente (P. aeruginosa, E. coli, S. typhimurium), mediante trattamento a freddo con CaCl 2 (bassa efficienza, utilizzato di routine nel clonaggio di DNA in E. coli) oppure elettroporazione. Nei Gram- : mancanza del fattore di competenza, sostituito da particolari condizioni del mezzo colturale. Ad esempio, 100% competenza in Haemophilus spp. in condizioni permissive per la sintesi proteica ma non per la crescita completa.

27 Trasformazione 1. Morte e degradazione del batterio donatore. 2. Un frammento di DNA bicatenario (ds) interagisce con specifiche proteine (DNA-binding protein) alla superficie della cellula competente. Il DNA è reso monocatenario (ss) da una nucleasi. 3. La proteina Rec A promuove la ricombinazione omologa tra il DNA ss donatore e quello ss recipiente. 4. Il trasferimento è completato.

28 Trasformazione

29 Trasformazione: significato Significato clinico: meccanismo di trasferimento di geni per l antibiotico-resistenza trasferimento di geni codificanti per fattori di virulenza (enterotossine, adesine, siderofori) Significato biotecnologico: clonaggio di geni utili Significato evoluzionistico: meccanismo di evoluzione/adattamento batterico

30 Trasduzione La trasduzione consiste nel trasferimento di frammenti di DNA cromosomale tra due cellule batteriche mediante un batteriofago (virus batterico). Esistono 2 tipi di trasduzione: Trasduzione generalizzata: qualsiasi gene può, in teoria, essere trasferito Trasduzione specializzata: specifici geni possono essere trasferiti con maggiore probabilità

31 Trasduzione La trasduzione consiste nel trasferimento di frammenti di DNA cromosomale tra due cellule batteriche mediante un batteriofago (o fago). Il fago è un virus in grado di infettare elettivamente le cellula batteriche. Ha generalmente forma di spillo in cui si riconoscono più parti: la testa, contenente l'acido nucleico; essa sormonta un collare, cui è attaccata una coda, la quale si sfrangia all'estremità in 5 o 6 fibre affatto libere.

32 Fago: ciclo biologico Il riconoscimento dell ospite da parte del fago avviene attraverso un legame che si stabilisce fra le proteine del capside e specifici recettori siti sulla parete del batterio. Nella coda del fago è presente un complesso molecolare in grado di iniettare l acido nucleico del fago attraverso la parete del batterio ospite. Una volta che l acido nucleico è penetrato nella cellula, a seconda del tipo di fago si potrà osservare: un ciclo litico: il virus si riproduce immediatamente, uccidendo la cellula ospite che va incontro a lisi, liberando la progenie fagica. Un virus che si riproduce esclusivamente attraverso il ciclo litico viene definito virulento. un ciclo lisogeno: il virus integra il proprio acido nucleico nel genoma della cellula ospite (profago). I batteri che ospitano particelle virali non litiche sono detti lisogeni ed i virus vengono definiti temperati. Il profago può rimanere silente per molto tempo, fino a quando verrà attivato e, abbandonando il cromosoma batterico, innescherà un ciclo litico. La capacità di passare dal ciclo lisogeno a quello litico è di grande vantaggio evolutivo per il fago. Quando la cellula ospite è in fase di rapida crescita e riproduzione, il profago rimane nello stato lisogeno. Quando, invece, la cellula ospite viene danneggiata (es. agenti mutageni), il profago interrompe lo stato quiescente «integrato» ed attiva il ciclo litico per disseminare la propria progenie.

33 Trasduzione A seconda del tipo fagico coinvolto (virulento o temperato), il meccanismo di trasduzione può avvenire secondo due differenti modalità: Trasduzione generalizzata: in cui qualsiasi gene può (teoricamente) essere trasferito Trasduzione specializzata: in cui solo specifici geni possono essere trasferiti

34 Trasduzione generalizzata 1. Adsorbimento del fago litico alla superficie del batterio sensibile. 2. Penetrazione del genoma fagico nel batterio. Utilizzo dei sistemi metabolici cellulari per la sintesi e l assemblaggio delle componenti virali. 3. In alcuni casi, un frammento di DNA batterico od un plasmide possono essere erroneamente inseriti in alcuni capsidi virali (particelle trasducenti). 4. Rilascio dei fagi batterici a seguito di lisi batterica. 5. Il fago trasduttore adsorbe ad un batterio sensibile. 6. Penetrazione del DNA fagico. 7. Il fago trasducente non è in grado di innescare un ciclo litico ma può permettere al DNA fagico di ricombinare con il DNA della cellula accettrice. Nella trasduzione generalizzata, la selezione dei geni trasdotti è randomizzata. Ogni gene ha la stessa probabilità di essere trasdotto.

35 Trasduzione generalizzata

36 Trasduzione specializzata Un fago temperato adsorbe al batterio sensibile e vi inietta il suo genoma. Il genoma fagico ricombina con il nucleoide batterico divenendo un profago. In presenza di stimoli adeguati, un frammento del DNA batterico viene escisso come parte del genoma fagico. Durante la replicazione fagica il DNA batterico viene inserito nel genoma fagico. Tutti i fagi veicolano il frammento di DNA batterico. Il fago adsorbe ad una batterio sensibile iniettandovi il suo genoma. Il genoma fagico contenente il DNA trasdotto ricombina con il nucleoide della cellula accettrice Nella trasduzione specializzata, i geni batterici «fiancheggianti» il profago sono quelli a più alta probabilità di trasduzione.

37 Trasduzione specializzata

38 Ricombinazione genica Ciascuno dei tre meccanismi di trasferimento genico (coniugazione, trasformazione, trasduzione) può concludersi con la integrazione del DNA donatore in quello della cellula accettrice. Questo fenomeno è noto come ricombinazione genica. Sono coinvolti enzimi responsabili della sintesi e del riparo del DNA. Possono ricombinare sia singoli geni che gruppi di geni. La ricombinazione genica è coinvolta in ogni fenomeno generante variabilità genica: è un processo di riarrangiamento del DNA che porta alla fusione di frammenti appartenenti a molecole di DNA differenti. Importante processo evolutivo in quanto promuove la diversità genetica (formazione di nuove combinazioni di geni), permettendo un rapido adattamento. Due tipologie di ricombinazione genetica: omologa, richiede elevata omologia tra sequenze estese sito-specifica, riconosce omologia tra sequenze brevi Ricombinazione tra DNA lineare (a) e plasmidico (b)

39 Ricombinazione genica OMOLOGA (crossing over) Necessita di estese regioni di omologia tra DNA ricevente e donatore. Molto complessa (in E. coli richiede oltre 25 geni). 1. Taglio di una elica del DNA donatore ad opera di una endonucleasi. 2. Separazione del filamento tagliato da quello integro ad opera di una elicasi e sua associazione a proteine stabilizzatrici (Single-Strand Binding protein SSB protein). 3. Legame con proteina RecA che rende possibile l invasione di catena ed il conseguente appaiamento del filamento donatore con sequenze omologhe del DNA ricevente. 4. Formazione di una struttura chiamata heteroduplex, ossia l intermedio di ricombinazione. 5. Risoluzione dell heteroduplex: rottura e successiva risaldatura dei filamenti mediante DNA-ligasi, con formazione di molecole di DNA ibride.

40 Ricombinazione genica SITO-SPECIFICA Avviene in particolari punti del DNA aventi una particolare sequenza riconosciuta da trasposasi e ricombinasi sito-specifiche. Necessita di corte sequenze (qualche base) di omologia tra DNA bersaglio e DNA sequenze invertite e ripetute (IR). Consente la trasposizione, ossia la traslocazione di sequenze da un sito ad un altro dello stesso genoma o tra genomi differenti: integrazione del fago inversione degli elementi invertibili (es. variazione di fase flagellare H1/H2 in S. typhimurium) trasposizione di elementi trasponibili

41 Conversione lisogenica Integrazione del genoma fagico mediante ricombinazione sito-specifica DNA profagico silente (anche per lunghi periodi) Particolari condizioni ambientali (carenza ionica, essiccamento, U.V., radiazioni ionizzanti, agenti mutageni) inducono la derepressione di parte del DNA profagico La conversione lisogenica può accrescere la virulenza (patogenicità) di un batterio: adesine ed antigeni di superficie (antigene O di Salmonella) produzione di tossine

42 Adattamento ed evoluzione batterica Mutazione e selezione classiche (selezione naturale ed evoluzione) Acquisizione di geni da altri batteri: Trasferimento genico ORIZZONTALE: Coniugazione Trasformazione Ricombinazione genica (omologa o sito-specifica) Trasduzione Trasferimento genico VERTICALE

43 Adattamento ed evoluzione batterica Quantità (valori percentuali) di DNA atipico (trasferito) nei genomi batterici. Circa il 13% del genoma di E. coli K12 è stato acquisito mediante trasferimento genico orizzontale.

44 Espressione genica La maggior parte (>98%) dei geni viene trascritta in mrna che viene poi tradotto in proteine. Alcuni geni codificano per le diverse specie di RNA ribosomale (5S, 16S, 23S); altri in RNA transfer (trna) che, insieme con il ribosoma, partecipano alla decodificazione di mrna in proteine funzionali. La trascrizione inizia a partire dai promotori, sequenze in grado di legare RNA-pol, che modulano la frequenza di inizio del fenomeno. La attività dei promotori può essere alterata da proteine regolatrici. La trascrizione termina con specifici siti di terminazione: sequenza IR seguita da un poli-uracile; formano «stem-loop» incompatibile con attività della RNA-pol proteina di terminazione (rho) In alcuni casi, i geni sono disposti singolarmente sul cromosoma: da questi geni viene trascritta una singola specie di mrna che è tradotta in un singolo tipo di proteina (arrangiamento monocistronico)

45 Espressione genica In altri casi, più geni che codificano per funzioni correlate possono trovarsi adiacenti sul cromosoma («clusters») e vengono trascritti, a partire da un singolo promotore, su una singola molecola di mrna, dalla cui traduzione verranno poi formate tante proteine quanti sono i geni che fanno parte del gruppo. Tale gruppo di geni costituisce un operone (arrangiamento policistronico). L arrangiamento in operoni dei geni è tipico di molti batteri e vantaggioso perché permette di economizzare sui meccanismi di regolazione: il raggruppamento in operoni di geni con funzioni correlate, che richiedono quindi una regolazione dell espressione simile, riduce il numero di sistemi di regolazione richiesti. Molte delle proteine responsabili della virulenza batterica sono codificate da operoni: tossina colerica (V. cholerae) fimbrie (pili) di E. coli uropatogeni

46 Regolazione dell espressione genica I batteri possono regolare in maniera «fine» la espressione dei propri geni. La capacità di «attivare» o «disattivare» geni selezionati consente loro di: adattarsi facilmente ai cambiamenti dell ambiente (ricerca di nuove sorgenti di C/N; sintesi de novo di una molecola) regolare il proprio livello di virulenza. Esempio: batteri enteropatogeni: passaggio dall ambiente «acqua» (25 C, carenza di elementi nutritivi) all ospite (37 C, carenza di O 2, riduzione di Fe libero). Geni ed operatori controllati da uno stesso regolatore costituiscono un regolone