Natura delle mutazioni GASP. GASP: Growth Advantage in Stationary Phase. Competizione all interno di popolazioni miste: il futuro è dei vecchi

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Ada Rubino
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1 Dinamiche di popolazioni nella fase stazionaria: il fenomeno GASP Competizione all interno di popolazioni miste: il futuro è dei vecchi Colture fresche (A), non adattate A B Domanda iniziale: La fase di morte* dopo la crescita è dominata da eventi stocastici o determinati? *= la morte batterica corrisponde a non coltivabilità/ integrità di membrana Colture vecchie (B), adattate a lunghi periodi di noncrescita La competizione tra batteri originati dallo stesso batterio viene sempre vinta dalle colture con più lunghi periodi di adattamento alla fase stazionaria. Questo suggerisce processi di adattamento e/o di selezione di mutazioni in condizioni di non crescita. GASP: Growth Advantage in Stationary Phase Natura delle mutazioni GASP Incremento dell espressione di sistemi di trasporto per carboidrati Eventi di mutazione determinano una costante evoluzione della popolazione batterica Una mutazione frequente che conduce al fenotipo GASP ha luogo nel gene rpos (fattore sigma alternativo specifico per la fase stazionaria) Inattivazione di regolatori globali indotti nella fase stazionaria come rela (sintesi di ppgpp) o rpos (fattore sigma alternativo σ S ; mutazioni spesso reversibili) Quindi i geni coinvolti nell adattamento alla fase stazionaria sembrano svantaggiare la sopravvivenza della cellula a lungo termine!

Un possibile modello per il fenotipo GASP: i sistemi TA (tossina/antitossina) Diversi sistemi TA sembrano dipendere strettamente da geni di adattamento alla fase stazionaria!

2 Un possibile modello per il fenotipo GASP: i sistemi TA (tossina/antitossina) Diversi sistemi TA sembrano dipendere strettamente da geni di adattamento alla fase stazionaria! Un esempio di sistema plasmidico di tossina/antitossina: pard (kis/kid) Tossina: proteina stabile (basso livello di trascrizione) Antitossina: proteina instabile (livello di trascrizione + alto) I sistemi TA si ritrovano frequentemente su plasmidi ed elementi mobili, con l unica apparente funzione di eliminare i microrganismi (ricombinanti, segreganti ecc.) che non ne mantenessero la sequenza codificante (cosiddetto selfish DNA ) ecnab (membrane poison) Espressione della tossina dipende da σ S mazef (inibitore DNA girasi) Presenza di ppgpp (gene rela) induce l accumulo della tossina MazF Meccanismo d apoptosi a livello di popolazione: il sacrificio di molti per la sopravvivenza di pochi To GASP or not to GASP this is the question. Rallentamento metabolico Induzione sistemi TA Lisi cellulare Subpopolazione GASP: Subpopolazione non mutata: Mutazioni bloccano l attivazione di sistemi TA Rilascio del contenuto intracellulare; nuova disponibilità di sostanze organiche Maggiore sensibilità a stress cellulari Minore competitività nella crescita veloce Morte da sistemi TA durante prolungata fase stazionaria Crescita cannibalistica della subpopolazione mutata Reversione al fenotipo WT in condizioni di crescita Favorita in fase stazionaria prolungata Favorita in situazione di crescita

Biologia dei biofilm... J. Bacteriol. 25, 277-286 (1933) aus C. E.

46, 39-56 (1943) Importanza dei biofilm microbici BIOFILM Comunita ben

polimerica prodotta dalle cellule stesse, e che cresce su superfici

Biofilm come fattore di virulenza: infezioni da biofilm più virulente,

ad una superficie solida o flocculati sono utilizzati preferenzialmente

3 Biologia dei biofilm... J. Bacteriol. 25, (1933) aus C. E. Zobell: "The effect of surfaces on bacterial activity", J. Bacterio l. 46, (1943) Importanza dei biofilm microbici BIOFILM Comunita ben strutturata di batteri e cellule eucariotiche racchiuse in una matrice polimerica prodotta dalle cellule stesse, e che cresce su superfici (inerti o biologiche ), soprattutto all interfaccia con una fase liquida Biofilm come fattore di virulenza: infezioni da biofilm più virulente, più tendenti a cronicizzarsi e più resistenti alle terapie Batteri adesi ad una superficie solida o flocculati sono utilizzati preferenzialmente in bioreattori industriali e nella depurazione delle acque di scarico I biofilm sono ubiquitari

Un caso reale di biofilm misto come osservato in microscopia

biofilm: la piastra microtiter Il biofilm come risposta a

Adesione Colonizzazione Maturazione Condizioni non ottimali di

favoriscono la formazione di biofilm in piastre microtiter

elettrica) EPS: produzione/organizzazione Polisaccaridi

4 Un caso reale di biofilm misto come osservato in microscopia elettronica Un sistema semplice per la determinazione del biofilm: la piastra microtiter Il biofilm come risposta a stress ambientali? Adesione Colonizzazione Maturazione Condizioni non ottimali di crescita (bassa temperatura, scarsità di sostanze nutritive) favoriscono la formazione di biofilm in piastre microtiter Interazioni fisico-chimiche Pili (idrofobicità, carica elettrica) EPS: produzione/organizzazione Polisaccaridi (alginato) Flagello Quorum sensing Fattori di aggregazione cellulare Proteine di membrana (curli, ecc ) esterna, parete cellulare, LPS..

solide che nell interazione cellula-cellula Cell-surface interaction Cell-cell aggregation pili di tipo I curli recettore del mannosio fibronectina Ma la funzione di questi fattori è sicuramente più

5 Fattori di virulenza e di adesione: specifici o non-specifici? A diversi fattori importanti nella formazione dei biofilm è stata assegnata una funzione specifica di interazione con proteine dell ospite Curli: un fattore coinvolto sia nell adesione a superfici solide che nell interazione cellula-cellula Cell-surface interaction Cell-cell aggregation pili di tipo I curli recettore del mannosio fibronectina Ma la funzione di questi fattori è sicuramente più generica.. La regolazione dei fattori di adesione/aggregazione cellulare è spesso complessa e modulata da sistemi di regolazione a due componenti Numerose mutazioni non inibiscono la formazione di biofilm, ma ne alterano le caratteristiche Curli: Espressi a: osmolarità medio-bassa (regolatore positivo: OmpR regolatore negativo: CpxR) Fase stazionaria/crescita lenta (regolatore: σ S ) bassa temperatura (Crl, regolatori non identificati)

Numerose mutazioni non inibiscono la formazione di biofilm, ma ne alterano le caratteristiche La formazione di biofilm è correlata con la coniugazione ed il trasferimento

orizzontale Permette di trasferire plasmidi coniugativi, (evtl.

strategia di adattamento L alta frequenza di coniugazione nei biofilm rappresenta quindi un vantaggio di questa forma di organizzazione cellulare Il sacro Graal del biofilm: il

6 Numerose mutazioni non inibiscono la formazione di biofilm, ma ne alterano le caratteristiche La formazione di biofilm è correlata con la coniugazione ed il trasferimento orizzontale di materiale genetico Pilus Due effetti dell espressione del pilus: consente la coniugazione batterica e stimola la produzione di biofilm Trasferimento genico orizzontale Permette di trasferire plasmidi coniugativi, (evtl. con trasposoni annessi) o frammenti cromosomali Tra i geni trasmessi, resistenza ad antibiotici ed enzimi di degradazione di sostanze organiche Considerato come un efficiente strategia di adattamento L alta frequenza di coniugazione nei biofilm rappresenta quindi un vantaggio di questa forma di organizzazione cellulare Il sacro Graal del biofilm: il segnale cellulare di adesione avvenuta Si è identificato un numero crescente di geni/proteine espressi solo o preferenzialmente in cellule adese ad una superficie solida. (alginato, OmpX ) Il meccanismo molecolare di questo processo (probabilmente mediato da sistemi di regolazione a due componenti) non è ancora stato definito

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