Biologia dei biofilm

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1 Biologia dei biofilm... J. Bacteriol. 25, (1933) aus C. E. Zobell: "The effect of surfaces on bacterial activity", J. Bacterio l. 46, (1943) BIFILM Comunita ben strutturata di batteri e cellule eucariotiche racchiuse in una matrice polimerica prodotta dalle cellule stesse, e che cresce su superfici (inerti o biologiche ), soprattutto all interfaccia con una fase liquida

2 Importanza dei biofilm microbici Biofilm come fattore di virulenza: infezioni da biofilm più virulente, più tendenti a cronicizzarsi e più resistenti alle terapie Batteri adesi ad una superficie solida o flocculati sono utilizzati preferenzialmente in bioreattori industriali e nella depurazione delle acque di scarico I biofilm sono ubiquitari Un caso reale di biofilm misto come osservato in microscopia elettronica

3 Adesione Colonizzazione Maturazione Interazioni fisico-chimiche Pili (idrofobicità, carica elettrica) EPS: produzione/organizzazione Polisaccaridi (alginato) Flagello Quorum sensing Fattori di aggregazione cellulare Proteine di membrana (curli, ecc ) esterna, parete cellulare, LPS.. La formazione di biofilm è correlata con la coniugazione ed il trasferimento orizzontale di materiale genetico Pilus Due effetti dell espressione del pilus: consente la coniugazione batterica e stimola la produzione di biofilm

4 Trasferimento genico orizzontale Permette di trasferire plasmidi coniugativi, (evtl. con trasposoni annessi) o frammenti cromosomali Tra i geni trasmessi, resistenza ad antibiotici ed enzimi di degradazione di sostanze organiche Considerato come un efficiente strategia di adattamento L alta frequenza di coniugazione nei biofilm rappresenta quindi un vantaggio di questa forma di organizzazione cellulare Genomic analysis of biofilm-dependent gene expression through microarray analysis Biof. Single cells

5 Il numero di geni che si esprime in maniera diversa in singole cellule e nei biofilm comprende una % molto alta del genoma (10-30%). Tutti coinvolti nella formazione del biofilm? L eterogeneità di espressione genica riflette anche (soprattutto?) le diverse condizioni fisiologiche dei batteri in un biofilm complesso Aerobi, Crescita + veloce [ 2 ], Nutr. Anaerobi, Crescita + lenta

6 Quorum sensing: da curiosità evolutiva a processo biologico globale Vibrio fischeri Eurpymna scolopes Quorum sensing: espressione genica dipendente dalla concentrazione cellulare Molecola segnale Molecola segnale Attivatore trascrizionale Attivatore trascrizionale Gene target Gene target Bassa concentrazione cellulare Alta concentrazione cellulare

7 La comunicazione intercellulare da quorum sensing è favorita in biofilm piuttosto che in colture liquide Cultura liquida: cfu/ml Molecole segnale (in Gram negativi): acil-omoserin-lattoni (AHL o HSL) Quorum Sensing in Pseudomonas aeruginosa: Il sistema lasr/lasi e rhlr/rhli costituiscono una cascata regolativa C12-HSL C4-HSL

8 Geni regolati da Quorum Sensing in Pseudomonas aeruginosa Tre classi funzionali principali: fattori di virulenza, sintesi di EPS, uptake del ferro Studi genomici stimano al 5-6% la percentuale di geni regolati da QS Il cluster rhlr/rhli è così chiamato per il suo ruolo nella biosintesi dei rhamnolipidi Rhamnolipidi: un esempio di biosurfattanti e i responsabili della gliding motility

9 I promotori QS-dipendenti sono spesso co-regolati da meccanismi legati a stimoli ambientali/fisiologici (sito di legame per LuxR) Geni quorum sensing-dipendenti determinano la struttura ordinata all interno di un biofilm batterico

10 La biosintesi degli AHL ha come unico scopo la creazione di una molecola segnale Le proteine regolatrici della famiglia LuxR sono tipici regolatori di risposta

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12 Il QS è direttamente coinvolto in meccanismi di patogenesi nei mammiferi Gli induttori (molecole segnale) appartengono a classi chimiche diverse

13 Un caso a sé: gli Streptomyces S. coelicolor Streptomiceti/Attinomiceti: Batteri (Gram +) del suolo (30 C temperatura ottimale di crescita) rganismo multicellulare (Uniche forme monocellulari: spore e protoplasti) Sporigeno (su substrati solidi, spore in circa 7 gg) Crescita come micelio in terreno liquido Principale produttore di antibiotici Numero di RF predette S. coelicolor 7825 E. coli 4289 B. subtilis 4099 S. cerevisiae 6203 Geni regolatori: 65 fattori sigma TCRS: 85 sensor kinases 79 response regulators A factor : H identificato in S. griseus Mutanti incapaci di produrre A factor sono Spo -, Str S and Str - A factor aggiunto esternamente ripristina il fenotipo originario A factor lega il repressore ArpA, inibendone l attività E in grado di agire a concentrazioni nm Coinvolto nella produzione di numerosi composti antimicrobici

14 H A factor, S. griseus H H H H H S. bikiniensis, S. cyanofuscatus, S. viridochromogenes S. virginiae S. bikiniensis, S. cyanofuscatus γ-butirrolattoni in Streptomyces H H S. virginiae H H H S. virginiae H H S. virginiae H H H H S. virginiae Streptomyces sp. FRI-5 Quorum sensing in batteri Gram + Molecole segnale: peptidi (modificati) Processi biologici regolati da QS: Coniugazione, virulenza, produzione di enzimi extracellulari, adesione cellulare, formazione di biofilm Competenza Produzione di peptidi antimicrobici

15 Peptidi segnale (auto-induttori) in batteri Gram positivi Sistemi agr e com: una struttura comune agrd (virulenza in S. aureus) comx (competenza in B. subtilis)

16 Secrezione e uptake del peptide AgrD AgrC/A: sistema a due componenti AgrB: secrezione/modificazione AgrC: sensore P 4 A AgrA regolatore di risposta Il sistema agr si autoregola tramite un RNA (hld) hld modula l attività di AgrA e di altri regolatori globali

17 Schema generale del QS in Gram + Confronto tra processi di QS in Gram - e Gram + Feromoni: HSL Libera diffusione attraverso la membrana Sistemi a due componenti (entrambi citoplasmatici) Molecole segnale o feromoni Feromoni: peptidi Secrezione attiva Sistemi a due componenti: Un sensore inserito nella membrana Un regolatore citoplasmatico

18 La doppia vita dei peptidi segnale: attività antimicrobica Un vasto gruppo di peptidi segnale presenta un attività antimicrobica (generalmente mediata da destabilizzazione della membrana) particolarmente spiccata contro altri batteri Gram+ (plantaricina, enterocina, lantibiotici) Particolarmente presenti in batteri lattici (importanti per biotecnologie alimentari) Un peptide antimicrobico utile : la nisina Prodotta da lactobacilli; espressione richiede alta densità cellulare (QS) unitamente a fase stazionaria di crescita. Ampio spettro d azione contro Gram + (a concentrazioni nm) Prodotta spontaneamente (o aggiunta) nella preparazione dei formaggi

19 Se ricordiamo lo schema generale del QS in Gram+...possiamo comprendere il sistema di produzione e processamento della nisina! ltre al sistema di modificazione/esporto e di trasduzione del segnale, i ceppi produttori di nisina posseggono geni per l immunità

20 Biosintesi e processamento dei lantibiotici Auto-regolazione (+ regolazione da segnali ambientali e fisiologici) Largo numero di geni coinvolti in: modificazione, esporto, trasduzione del segnale ed immunità (da 10 a 18) Interesse come nuovo agente antimicrobico e per applicazioni biotecnologiche (ind. alimentare) Anche i geni dell immunità sono sotto il diretto controllo della nisina

21 Nisin-controlled expression (NICE) Espressione di geni letali tramite induzione con nisina Enzimi intracellulari di lactobacillo sono essenziali nella maturazione dei formaggi La lisi controllata potrebbe accelerare e standardizzare questo processo

22 Referenze biofilm/qs Winzer, Hardie, and Williams. Bacterial cell-to-cell communication: sorry, can t talk now gone to lunch! Current pinion in Microbiology 2002, 5: Withers, Swift, and Williams. Quorum sensing as an integral component of gene regulatory networks in Gram-negative bacteria. Current pinion in Microbiology 2001, 4: Toole and Kolter. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Mol Microbiol. 1998, 30: Toole, Kaplan, and Kolter. Biofilm formation as microbial development. Annu Rev Microbiol. 2000, 54: Davies, Parsek, Pearson, Iglewski, Costerton, and Greenberg. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm. Science 1998, 10: Kleerebezem. Quorum sensing control of lantibiotic production; nisin and subtilin autoregulate their own biosynthesis Peptides 2004, 25: Web: (University of Montana) (Kolter lab) (Quorum sensing network)