INGEGNERIA METABOLICA. C. MAZZONI/BiotecnologieMicrobiche

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1 INGEGNERIA METABOLICA

2 2 INGEGNERIA METABOLICA apple Lo scopo dell Ingegneria metabolica è quello di dirigere specificamente il flusso attraverso un pathway metabolico, es. Un prodotto formato durante la fermentazione. Per fare ciò, è necessaria una profonda conoscenza della genetica e delle capacità metaboliche del microrganismo produttore.

3 3 INGEGNERIA METABOLICA - Latte e derivati - Lactococcus lactis vino/birra/pane - lieviti 1,3-propanediol - Clostridium, Pseudomonas - Streptomyces

4 4 INGEGNERIA METABOLICA - Lactococcus lactis vino/birra/pane - lieviti 1,3-propanediol - Clostridium, Pseudomonas - Streptomyces

5 5 Vantaggi dell uso dei LAB apple I LAB sono target ideali per questa strategia a causa del loro semplice metabolismo. Inoltre, se ne conosce bene la genetica e la fisiologia. Infine, sono organismi sicuri e usati da lungo tempo nell industria alimentare. apple Il maggior vantaggio dei LAB in ingegneria metabolica deriva dal fatto che in essi c è il completo disaccoppiamento tra vie cataboliche e vie di biosintesi cellulare. apple E così possibile permettere l interferenza, per esempio, nel catabolismo degli zuccheri senza interessare la biosintesi e viceversa. apple Inoltre, non producono tossine e non serve aggiungere antibiotici al processo di produzione

6 6 Lactococcus lactis apple Il Lactococcus lactis, appartenente alla famiglia dei batteri lattici (LAB), è il batterio lattico più usato come starter alimentare a livello industriale e il più largamente studiato a livelli fisiologici e genetici. apple Il L. lactis è un LAB omofermentativo che in normali condizioni di fermentazione batch converte lo zucchero principalmente in acido lattico mediante la Lattato Deidrogenasi (LDH). apple Come tanti altri LAB non contiene né una catena di trasporto degli elettroni funzionale né il ciclo dell acido citrico. L ATP è generato maggiormente dalla glicolisi mediante 2 reazioni di fosforilazione accoppiate alla riduzione di NAD+ in NADH. Il cofattore NAD+ è rigenerato attraverso l azione dell L- lattato deidrogenasi (L-LDH), la quale converte piruvato in L- lattato.

7 7 Lactococcus lactis: genetic tools apple Il genoma di L. lactis è stato recentemente sequenziato. apple In L. lactis, è stato scoperto un sistema molto efficiente a livello del controllo di espressione. Il sistema nisina-controllato, detto sistema NICE, è stato da allora applicato per l espressione omologa ed eterologa rigorosamente controllata dei geni in L. lactis. apple Il sistema di espressione controllata NICE di L. lactis è stato inoltre introdotto con successo anche nello S. thermophilus.

8 8 Lactococcus lactis: impieghi apple La ricchezza di conoscenza e l esperienza ha portato all uso dei lattococchi ben oltre i loro impieghi iniziali nella produzione di cibi fermentati. I lattococchi sono infatti impiegati in molti processi industriali che vanno dall espressione di antigeni batterici e virali per la vaccinazione sicura tramite immunizzazione mucosale alla produzione di agenti terapeutici e aminoacidi.

9 9 sistema NICE vantaggi food grade stretto controllo funziona in una varietà di Gram-positivi applicazioni efficiente produzione di proteine aromi vaccini strumento di ricerca per l ingegneria metabolica Colture autolitiche

10 10 Sistema controllato da Nisina NICE (NIsin Controlled Expression) H K H K K NISINA Peptide di 34 aa con 5 ponti disolfuro e 5 aa carichi a ph fisiologico La nisina è una batteriocina prodotta dal batterio acido lattico Lactococcus lactis, in grado di inattivare la flora microbica Gram (+) in quanto capace di ridurne la permeabilità della membrana citoplasmatica.

11 Metodi per accelerare la 11 maturazione del formaggio apple aumento della temperatura di stagionatura apple uso di starter aggiuntivi o modificati apple aggiunta di enzimi e uso di cheese slurries apple Poiché la crescita dei batteri lattici si arresta alla fine della formazione della cagliata, i loro enzimi intracellulari non sono efficaci fino alla morte e alla lisi della cellula. Si può immaginare che l accelerazione del processo di lisi porti di conseguenza ad un rilascio di enzimi precoce e ad un aumentata velocità di maturazione del formaggio

12 Ruolo dei batteriofagi nella lisi 12 batterica apple Nei batteriofagi di E. coli (es.lamba), la lisi cellulare dipende dalla presenza di due proteine codificate dal batteriofago denominate oline ed endolisine. Le oline probabilmente formano dei buchi sulla membrana citoplasmatica, mentre le endolisine degradano lo strato di peptidoglicano. apple Attraverso il sistema NICE è stata ottenuta con successo l espressione dei geni litici lyta e lyth, che codificano per una lisina e una olina rispettivamente del batteriofago dei lattococchi US3

13 13 sistema NICE - colture autolitiche Applicazioni della lisi controllata Maturazione del formaggio accelerata Controllo del rilascio di proteine nisa

14 14 Rilascio di un enzima intracellulare PepN: aminopeptidasi N Enzima intracellulare con attività che toglie l amaro L espressione simultanea di endolisina e olina ha portano ad un aumento di circa 4 volte il rilascio di L- lattato deidrogensi nella cagliata

15 15 Prova nel corso della stagionatura Control LytH LytA-LytH Control LytH LytA-LytH Control LytH LytA-LytH L espressione simultanea di endolisina e olina ha portano ad un aumento di circa 4 volte il rilascio di L- lattato deidrogensi nella cagliata La nisina può essere fornita da uno starter produttore inoculato insieme agli altri starters

16 16 Lactococcus lactis

17 17 L-alanina L-alanina = usata come dolcificante e applicazioni farmaceutiche per la somministrazione parenterale in terapie cliniche nutrizionali pre e postoperatorie. La produzione di L-aminoacidi (Ala, Asn, gln, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Tyr) ammonta a 1000tonnellate/anno. Venduti a 50$/Kg. Diverse sono state le strategie usate per ottenere una produzione esclusiva di L-alanina. E stato sviluppato un processo industriale per la produzione di L-alanina attraverso la decarbossilazione dell L-aspartato. Questo processo usa immobilizzare cellule o sospensioni cellulari di Pseudomonas dacunhae come biocatalizzatori con una produzione superiore al 90%. Tentata la produzione di L-alanina in E.coli mediante la co-espressione di formato deidrogenasi e alanina deidrogenasi.

18 Altre strategie 18 Si cercò di produrre l L-alanina anche a partire direttamente dal piruvato (L =80%) ma la produzione diminuiva all aumentare della concentrazione del piruvato ed inoltre la concentrazione di isomero D-alanina aumentava con il tempo di incubazione e ciò era dovuto all attività dell alanina racemasi. Gran parte della popolazione mondiale soffre di intolleranza al lattosio ed esistono LAB specifici in grado di eseguire questa conversione. Tra questi LAB vi è per esempio nello yogurt lo S. thermophilus. Una caratteristica speciale del metabolismo di questo batterio è che utilizza soltanto il glucosio del lattosio, con conseguenza che i prodotti fermentati contengono elevate quantità di galattosio residuo. Il galattosio non è fermentato dalla maggior parte dei ceppi lattiero-caseari del batterio S. thermophilus. Questo è il risultato dell'assenza della trascrizione del gene che codifica per dell enzima galattochinasi. Ciò è causato da mutazioni isolate nella regione del promotore gal. A tale riguardo, la recente scoperta che il metabolismo del L. lactis può essere completamente convertito verso la produzione dell' L-alanina anziché verso l acido lattico, mediante clonazione dell alanina deidrogenasi in questo microrganismo, apre interessanti possibilità per eliminare efficacemente il lattosio. Il prodotto fermentato sarà non soltanto esente da lattosio, ma la dolcezza ed il gusto generale saranno aumentati in seguito a formazione dell'l-alanina.

19 Re-routing del pathways di fermentazione 19 Sugar X

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21 Lactococcus - network di fermentazione 21 Sugar

22 22 Bacillus sphaericus

23 23 1. La produzione di L-AlaDH è proporzionale alla concentrazione di nisina usata 2. Al di sopra di 1ng/ml non si ottiene un ulteriore aumento di 3. AlaDH purificata da B. sphaericus ha un attività specifica di 157 U/mg proteina e rappresenta il 20% delle proteine totali. Alle massime condizioni di induzione, la L-AlaDH aumenta al 30-40% circa delle proteine totali.

24 24 Figura 2B

25 wt Mut ldh Misura della produzione di alanina nel ceppo selvatico e nel ceppo dove è stata inattivata la lattico-deidrogenasi 2. Entrambe i ceppi producono alanina ad un tasso di conversione dipendente dalla concentrazione di nisina ( fig 3A) e dal supplemento di ammonio (fig 3B). 3. La produzione di alanina nel ceppo mutante LDH-deficiente, rispetto al wild-type, è sempre più elevata. Ciò è dovuto probabilmente all assenza di competizione nel mutante tra AlaDH e LDH.

26 wt 26 wt Alla massima induzione di AlaDH, i prodotti finali del ceppo wild-type erano costituiti da: lattato per il 65% e alanina per il 35%. Nel mutante L-ldh (fig 4) i prodotti finiti erano costituiti da: alanina ( 50%) e acetoina (35%) insieme a piccole Q di: etanolo ( 8%) formato (2%) e lattato (1,5%) La produzione residua di L-lattato nel mutante suggerisce la presenza di vie alternative per la produzione di lattato. Queste informazioni fanno dedurre che L-AlaDH può competere con L-LDH in wild-type e con le vie alternative del catabolismo del piruvato.

27 Ruolo del ph I diversi enzimi del pathway hanno ph ottimali diversi 27 Diacetile Acetoina 2,3-butanediolo ph =6.0 ph = Piruvato L-Ala Etanolo Acetaldeide Lattato ph <7.5 Formato Acetato L optimum di ph per l AlaDH è7.5. Poiché gli altri enzimi non funzionano a questo ph, se si tiene il ph del terreno a 7.5 è possibile aumentare di molto il flusso di carbonio attraverso il pathway AlaDH

28 28 Alanina Lattato Alanina Glucosio Glucosio Lattato

29 29 Di norma la proporzione dell isomero D sulla % di alanina totale è pari al 10-15% e una significante riduzione del D-isomero può essere realizzata in ceppi incubati con D-cloroalanina, un inibitore specifico di alanina racemasi. Facendo così si arriva ad una riduzione del D-isomero con una proporzione più o meno pari al 3% dell alanina totale. Tramite la soppressione del gene alanina racemasi Alr in L. lactis mediante ricombinazione omologa, si ottiene la produzione di L-Ala pura al 99%. La D-alanina è un componente del peptidoglicano e quindi viene fornita per assicurare la crescita durante la fase di induzione da parte di nisina. La D-alanina viene seguito rimossa nella fase di lavaggio che precede la fermentazione finale.

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