Batteri nell ambiente: testimoni e/o attori principali. Biosensori vs. Biorimediatori I-Biosensori. II-Biorimediatori. Pseudomonas

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Geraldina Casali
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1 Batteri nell ambiente: testimoni e/o attori principali Specifici microrganismi possono essere utilizzati come biosensori,, cioè come strumenti di detezione e di determinazione della presenza di sostanze tossiche/inquinanti Microrganismi vengono utilizzati per promuovere o accelerare il risanamento ambientale (bioremediation( bioremediation) I-Biosensori Escherichia coli,, e batteri del genere Pseudomonas, P. putida in particolare - L attività di un biosensore si limita alla rilevazione di un composto inquinante di interesse - Può essere utilizzato in condizioni di laboratorio (a cui viene aggiunto il campione da testare) - Organismo geneticamente ben caratterizzato e disponibilità di mutanti - Disponibilità di vettori di clonaggio ed espressione espressi stabilmente II-Biorimediatori Pseudomonas sp., Rhodococcus, Sphingomonas, Mycobacterium, Rhizobium,, batteri non identificabili e/o consorzi microbici. - Devono essere in grado di degradare in maniera consistente le sostanze inquinanti di interesse - Devono essere attivi in situ,, cioè nell ambiente naturale - Devono persistere nell ambiente senza turbarne la biodiversità - Devono possedere attività biodegradativa endogena (non essere geneticamente modificati, a meno che possa essere contenuta la loro dispersione nell ambiente)

2 I-Biosensori Escherichia coli,, e batteri del genere Pseudomonas, P. putida in particolare - L attività di un biosensore si limita alla rilevazione di un composto inquinante di interesse - Può essere utilizzato in condizioni di laboratorio (a cui viene aggiunto il campione da testare) - Organismo geneticamente ben caratterizzato e disponibilità di mutanti - Disponibilità di vettori di clonaggio ed espressione espressi stabilmente Impiego di batteri biosensori e loro problematica Pseudomonas putida, Escherichia coli, ecc. - L impiego di biosensori è alternativo o complementare a strumenti analitici per risk assessment (es. valutazione della concentrazione di inquinante) - Facilità e convenienza d uso d (ma risposta semiquantitativa) - Selettività del riconoscimento di composti chimici: (es. isomeri di composti organici, metalli pesanti) derepressione Promotori inducibili: (es. operoni per la degradazione di substrati complessi, induzione da stress cellulari, detossificazione) Espressione indotta esclusivamente in risposta ad uno stimolo specifico mediato dall accumulo di un induttore attivazione

3 Molti promotori inducibili sono di interesse biotecnologico ambientale operoni per la degradazione di substrati complessi, Es. idrocarburi, substrati aromatici induzione da stress cellulari, detossificazione Es. metalli pesanti (Hg, Cr) Gli operoni per la degradazione di substrati complessi (es. composti aromatici come toluene e xylene) sono a loro volta piuttosto complessi! Plasmidi psvs/ptols Situazione fisiologica; ceppo wild type Geni controllati da un promotore di interesse Es. codificanti per geni per la degradazione Biosensore Gene reporter: codifica una proteina la cui attività può essere facilmente saggiata; La fusione promotore::gene reporter (es. xyle::lacz) può essere costruita inattivando l operone originale o clonando il promotore a monte di un gene reporter, generalmente su un plasmide Promotore di interesse clonato a monte di un gene reporter Rep. gene

Principali geni reporter comunemente utilizzati in microrganismi Protein CAT (chloramphenicol acetyltransferase) GAL (β galactosidase) GUS (β glucuronidase) LUC (luciferase) GFP (green fluorescent

Hydrolyzes colorless glucuronides to yield colored products. (PNPG). Oxidizes luciferin, emitting photons. Fluoresces on irradiation with UV.

4 Principali geni reporter comunemente utilizzati in microrganismi Protein CAT (chloramphenicol acetyltransferase) GAL (β galactosidase) GUS (β glucuronidase) LUC (luciferase) GFP (green fluorescent protein) Activity & Measurement Transfers radioactive acetyl groups to chloramphenicol. Hydrolyzes colorless galactosides to yield colored products (X-gal, ONPG). Hydrolyzes colorless glucuronides to yield colored products. (PNPG). Oxidizes luciferin, emitting photons. Fluoresces on irradiation with UV. Un gene reporter visuale : la green fluorescent protein (GFP) Use of GFP to detect response to 3-chlorobenzoate 3-ChlB 3-ChlB Determinazione di espressione di β-galattosidasi su piastre McConkey contenenti X-gal Legame scisso dalla β-galattosidasi X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolylβ -galactopyranoside) Negativo Positivo

5 Utilizzo di geni reporter per lo sviluppo di biosensori: Problemi concettuali e tecnici

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