Dott. Giovanni DI BONAVENTURA

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Gianluigi Valle
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1 Crescita batterica Dott. Giovanni DI BONAVENTURA Laboratorio di Microbiologia Clinica (5 livello, lab n. 27) Centro Scienze dell Invecchiamento (Ce.S.I.) Università G. D Annunzio di Chieti e Pescara [email protected]

2 Crescita batterica fissione binaria

3 Fissione binaria E. coli può dividersi ogni 20 minuti. Quindi, esso deve sintetizzare (duplicare) tutti I suoi componenti cellulari entro questo tempo

4 Crescita batterica divisione cellulare Durante la divisione, l aumento dei costituenti cellulari può tradursi in: aumento delle dimensioni cellulari microrganismi cenocitici presentano divisioni nucleari che non sono accompagnate da divisioni cellulari aumento del numero cellulare La Microbiologa generalmente studia la crescita di una popolazione piuttosto che la crescita delle singole cellule

5 Microrganismi cenocitici Rhodophyta spp. (alga rossa)

6 Cinetica della divisione cellulare La curva di crescita Osservata quando i microrganismi vengono coltivati in terreno liquido (brodo) Misura la variazione della quantità (massa totale o concentrazione) di batteri nel tempo: rappresentazione grafica di tipo semilogaritmica Log 10 (concentrazione cellulare espressa come CFU/ml, dove CFU= unità formanti colonie) vs tempo Generalmente, si articola in 4 fasi (periodi) distinte e sequenziali

8 Fase di latenza (lag phase) Fase di adattamento metabolico: Sintesi di nuovi enzimi per il metabolismo cellulare Sintesi di nuovi componenti strutturali cellulari Numero cellulare costante; lieve aumento volumetrico Durata variabile (specie-specifica): in alcuni casi può essere di breve durata od assente

9 Fase esponenziale (log phase) Tutti i microrganismi sono in fase di riproduzione attiva Gli eventi riproduttivi (di ciascuna cellula della popolazione) non avvengono nello stesso tempo (coltura non sincronizzata) Velocità di crescita costante nel tempo: Aumento del numero cellulare Aumento della massa cellulare totale Popolazione uniforme per proprietà chimico-fisiche Chiamata anche fase logaritmica

11 Coltura non sincronizzata: ogni cellula si riproduce a tempi leggermente differenti La curva ha andamento lineare

12 Crescita cellullare Modello matematico Tempo di generazione: tempo necessario perchè il numero cellulare raddoppi Mean growth rate constant numero di generazioni per unità di tempo espresso come n. generazioni / h

13 N t = n. cellule al tempo t N o = n. cellule al tempo 0 n= n. generazioni al tempo t = n. generazioni nell unità di tempo t = tempo trascorso N t = N o x 2 n N t = N o x 2 t logn t = logn o + t k = n/t = velocità di crescita g = t/n = tempo di generazione

14 doubling time or generation time (g)

16 Log phase (fase esponenziale) Crescita bilanciata Durante tale fase le cellule esibiscono una crescita bilanciata: i costituenti cellulari vengono sintetizzati a velocità costante ed in maniera congiunta Di contro, si osserva crescita non bilanciata, quando: Modificazione del livello dei nutrienti shift-up (terreno povero terreno ricco) shift-down (terreno ricco terreno povero) Modificazioni delle condizioni ambientali

17 Concentrazione di nutrienti vs crescita

18 Fase stazionaria Numero totale di cellulare vitali rimane costante: Arresto della riproduzione Tasso riproduttivo controbilanciato dal tasso di mortalità Possibili cause: Raggiungimento di una densità critica di popolazione Accumulo dei cataboliti (azione tossica) Limitazione dei nutrienti Limitata disponibilità di O 2

19 Fase di morte (declino) Morte cellulare a velocità esponenziale Morte: perdita irreversibile della capacità di riprodursi In alcuni casi, il tasso di mortalità rallenta causa un accumulo di cellule resistenti

20 Tecniche per la determinazione della densità cellulare Conta diretta cellulare Conteggio in camera contaglobuli Contatori elettronici Filtrazione su membrana Conta vitale cellulare Metodo della semina su terreno agarizzato Metodo di filtrazione su membrana

21 Conteggio mediante contaglobuli Semplice, economico e veloce Adatto per la conta degli eucarioti e dei procarioti NON fornisce informazioni sulla vitalità cellulare

22 Contatori elettronici Passaggio forzato della sospensione microbica attarverso un orifizio di piccole dimensioni Il batterio viene investito da una corrente elettrica applicata all orifizio Conteggio degli eventi interruzione della corrente elettrica Veloce e di semplice esecuzione Adatto per microrganismi di dimensioni rilevanti e per cellule ematiche NON distingue le cellule vive dalle morte

23 Conta vitale cellulare Determina il numero di cellule vitali La dimensione di popolazione viene espressa come unità formanti colonie (UFC oppure CFU: colonyforming units) Diluizioni seriali (10-fold) del campione Semina (su terreno solido) delle diluizioni del campione Conteggio del numero di colonie (UFC) Calcolo del numero di cellule nella popolazione

24 Conta vitale cellulare Diluizioni seriali (10-fold) del campione Semina (su terreno solido) delle diluizioni del campione Conteggio del numero di colonie (UFC) Calcolo del numero di cellule nella popolazione UFC/ml = n UFC x fattore diluizione

25 Metodo delle membrane filtranti Particolarmente adatto per l analisi dei campioni ambientali

26 Misura della massa cellulare Peso secco tempi lunghi scarsamente sensibile Quantità di un particolare costituente cellulare proteina, DNA o ATP adatto se la quantità del composto è costante in ogni cellula Misurazione torbidimetrica (light scattering) Veloce, semplice e sensibile

27 La densità ottica è la quantità di luce in grado di passare attraverso la sospensione batterica. Tanto maggiore sarà il numero cellulare, tanto più densa sarà la coltura. Questo significa che una quantità minore di luce sarà in grado di passare attraverso il campione e la coltura viene considerata essere torbida all esame visivo.

28 Colture continue Chemostato Coltura vecchia (in fase stazionaria) Coltura giovane (in fase logaritmica) Necessità di un modello che riproduca fedelmente la situazione in vivo Chemostato: Velocità del terreno in ingresso = velocità del terreno in uscita Nutriente essenziale in quantità limitanti Incremento costante del numero cellulare e della massa batterica

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