Analisi microbiologiche

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1 Analisi microbiologiche INTRODUZIONE Il fine delle analisi microbiologiche effettuate è quello di studiare la distribuzione dei microorganismi che si trovano sui fondali dei fiumi e in forme in sospensione, e di esprimere una valutazione oggettiva sulla qualità complessiva dell ambiente acquatico. La popolazione di organismi e microrganismi presenti nelle acque naturali e la varietà dei suoi componenti possono fornire importanti indicazioni sullo stato di salute delle acque stesse e dell ambiente circostante; per questa ragione rivestono un ruolo importante come bioindicatori. Nello studio che andiamo a presentare abbiamo escluso i macroinvertebrati bentonici (classe di organismi con dimensioni superiori al millimetro) che vivono a contatto con il fondo. Questi organismi, anche se molto interessanti dal punto di vista analitico dell osservazione, non sono stati presi in considerazione perché non abbiamo l esperienza e conoscenze adeguate per eseguire professionalmente l analisi. La nostra competenza in materia microbiologia è tarata sull osservazione, la classificazione e lo studio dei microorganismi, parte che ha occupato buona parte del nostro percorso di studi. CAMPIONAMENTO Il campionamento, ovvero il prelevamento dei campioni d acqua al fine dell indagine, è stato effettuato nel flusso corrente del fiume e non dal fondo. Le acque sono state analizzate entro 24 ore dal momento del prelievo, e ciò è a garanzia della veridicità dei risultati. I materiali utilizzati per il campionamento sono i seguenti: - Bottiglie sterili monouso in vetro Pyrex ed in materiale plastico. - Etichetta per identificare il campione e pennarello indelebile. PROCEDIMENTI Il primo passo è stato quello di decidere quali possibili parametri avremmo potuto utilizzare come indicatori dell inquinamento delle acque. L analisi microbiologica si è articolata verso due direzioni: osservazione al microscopio ottico e semina di colture batteriche in piastre. L analisi microscopica è stata condotta posizionando una goccia di ogni campione di acqua su un vetrino a goccia pendente di Koch coperto con l apposito copri-oggetto. La semina in piastre ha previsto prima la preparazione del terreno PCA, passando attraverso la pesata, la solubilizzazione e la sterilizzazione. Dopo aver diviso il terreno in varie piastre, abbiamo proceduto con la semina del campione secondo diversi procedimenti: Inclusione: Comporta l uso di pipette graduate precotonate in cui è inserito un piccolo tampone di cotone destinato ad evitare la contaminazione crociata del campione e dell operatore. Le pipette consentono il trasferimento di volumi precisi di liquidi nelle piastre Petri. Il successivo riempimento della piastra con un terreno agarizzato determina l intrappolamento delle singole cellule nel terreno. La semina per inclusione è una particolare tecnica di semina che consente la conta delle colonie batteriche. Versando 1 ml di sospensione batterica in piastra Petri sterile e aggiungendo un terreno di uso generale (caldo, in modo che sia liquido) si otterrà una crescita diffusa nella piastra (bisogna effettuare movimenti orari e antiorari e a croce per disporre le cellule in tutta la piastra).

2 Solitamente, si effettuano diluizioni, in modo da ridurre il numero di cellule (UFC) in un ml: le diluizioni si effettuano in soluzione fisiologica (0.9% NaCl) sterile. Tecnica per spatolamento: Si versa il terreno nella capsula Petri e lo si lascia solidificare. Dopo la solidificazione si versa 1 ml di campione con la spatola sterile e si sparge per tutto il terreno con un movimento rotatorio. La semina per spatolamento utilizzata in questa situazione ha uno scopo identificativo: infatti, il fine di tale semina è quello di disporre omogeneamente, su tutta la superficie del terreno, i microrganismi presenti nel campione. Dopo la semina abbiamo messo ad incubare a 37 gradi per ore, per poi procedere con le osservazioni. OSSERVAZIONI Non abbiamo effettuato diluizioni scalari perché i campioni erano poco contaminati; occorre quindi ricordare che non tutte le acque presentano la stessa distribuzione di microorganismi: alcuni di essi sono presenti in acque particolarmente inquinate, altri vivono esclusivamente nelle acque pure e ben ossigenate. Batteri e protozoi ciliati, alcune specie di alghe come l euglena, Rotiferi come Rotaria neptunia saranno abbondati per esempio in acque con forte inquinamento organico, poveri di ossigeno, maleodoranti. Dalle nostre osservazioni è emersa la presenza di gusci di microinvertebrati tra cui rotiferi (nematelminti), copepodi (crostacei) ed anellidi; anche alcuni protisti come alghe unicellulari filamentose (alghe azzurre). Vale sicuramente la pena di approfondire il discorso del conteggio microorganismi perché è fondamentale per valutare la qualità igienica delle acque. Lo scopo è quello di verificare la quantità di microorganismi presenti per unità di volume o di peso di un campione in esame (ml di campione), tenendo conto che i microrganismi presenti in un campione si calcolano sulla base delle cellule vive e vitali e sia su quelle ormai morte ma ancora presenti. EUGLENA Poiché la vitalità di un microrganismo si identifica con la sua capacità di riprodursi, i metodi per la conta vitale si basano sulla dimostrazione di tale capacità e sono metodi indiretti, detti tali perché risalgono al numero di microorganismi presenti nel campione in base al numero di colonie che essi formano riproducendosi (tecniche colturali). Nella routine si parla di conteggio totale o carica microbica totale senza ulteriori specificazioni e si fa riferimento generalmente a tecniche indirette, che si eseguono generalmente su un terreno PCA.

3 ROTARIA NEPTUNIA Tabelle microbiologia -Per spatolamento Conta UFC Forma Margine Profilo Superficie Foto 1-Tavernole (sciamato) indefinita indefinito piatto liscia-lucida 2-Lodrino 15 Irregolare Ondulato Umbonato Liscia-lucida 3-Marcheno (sciamato) Rotonda Intero Piatto Liscia-lucida

4 4-Gardone (sciamato) Irregolare Ondulato Piatto liscia-lucida 5-Brione 1 Rizoide Lobato Piatto rugosa -Per inclusione Conta UFC 1-Tavernole ¼ >500 Forma Margine Profilo Superficie Foto 1. puntiforme 2. rotonda 1.intero 2.ondulato 1. piatto 2. piatto 1. liscia-lucida 2. liscia-lucida 2-Lodrino 4 Irregolare Intero Piatto liscia-lucida 3-Marcheno 23 Irregolare Intero Piatto liscia-lucida

5 4-Gardone ¼ > Puntifore 2. rotonda 3. irregolare 1. Intero 2. ondulato 3. ondulato 1. piatto 2. convesso 3. elevato 1. liscia-lucida 2. seccapolverosa 3. liscia-lucida 5-Brione 1 Puntiforme Ondulato Elevato liscia-lucida