Il controllo della crescita microbica

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1 Autore Bruno Pacifici Il controllo della crescita microbica crescita cellulare crescita di una popolazione batterica misurazione della crescita ciclo di crescita di una popolazione batterica La crescita è un aspetto essenziale delle funzioni di un microrganismo, in quanto il periodo di vita di una singola cellula è limitato nel tempo e la continuità della specie viene assicurata solo dalla crescita della popolazione. La maggior parte della trattazione verterà sulla cellula batterica, sia perché su di essa sono disponibili molte informazioni sia perché in molte situazioni pratiche è necessario disporre delle conoscenze opportune per limitare la crescita batterica. Crescita cellulare Nella maggior parte dei microrganismi la crescita continua fino a quando la cellula si divide in due nuove cellule, un processo chiamato scissione binaria (binaria per indicare il fatto che due cellule si sono originate da una sola cellula). In una coltura in crescita di un batterio a forma di bastoncello, come per esempio Escherichia coli, si può osservare che le cellule si allungano fino a circa il doppio della loro lunghezza media e che in seguito si forma un setto che alla fine separa la cellula in due cellule figlie. Questo setto viene chiamato setto trasverso e si forma dalla invaginazione della membrana cellulare e della parete a partire da direzioni opposte; entrambe le strutture crescono verso l'interno della cellula fino a separare completamente le due cellule figlie. La ripartizione tra le due cellule figlie della molecola di DNA replicata dipende dall'ancoraggio alla membrana del DNA stesso durante la divisione cellulare; la formazione del setto porta alla separazione delle due copie del cromosoma, una per ogni cellula figlia. Il tempo richiesto da un batterio per svolgere un ciclo di crescita completo è molto variabile e dipende da diversi fattori. sia nutrizionali che genetici. In condizioni nutrizionali ottimali, il batterio E. coli può completare il ciclo in circa 20 minuti; pochi altri batteri possono crescere anche più velocemente, ma per lo più la crescita è molto più lenta. Il controllo della divisione cellulare è un processo complesso e sembra essere intimamente connesso agli eventi di replicazione del cromosoma. Crescita di una popolazione batterica Con il termine velocità di crescita si intende la variazione del numero di cellule o della massa per unità di tempo. L`intervallo di tempo durante il quale si formano due cellule a partire da un singolo individuo è chiamato generazione, e il tempo richiesto per tutto il processo è il tempo di generazione. Il tempo di generazione è quindi il tempo necessario a una cellula per duplicarsi.. Molti batteri hanno tempi di generazione di compresi tra 1 e 3 ore, ma sono noti anche alcuni microrganismi che crescono molto velocemente, dividendosi in una decina di minuti, e altri che hanno tempi di generazione di parecchie ore o addirittura di giorni. Questa modalità di aumento della popolazione, in cui in un dato intervallo di tempo raddoppia il numero delle cellule, viene chiamata crescita esponenziale. Riportando in grafico i dati relativi al

2 numero delle cellule in funzione del trascorrere del tempo, si ottiene una curva con una pendenza che aumenta in modo costante. Questo tipo di grafico non permette un`analisi immediata, pertanto i dati relativi alla crescita di una popolazione vengono solitamente convertiti in valori logaritmici, calcolando il logaritmo di ogni singolo dato. Nella Figura sopra b sono stati utilizzati i valori del log 10, generando un grafico in cui il numero di cellule è riportato come logaritmo, mentre il tempo è riportato in scala aritmetica (grafico semilogaritmico); con questo accorgimento la crescita è rappresentata dalla funzione di una retta. In un grafico semilogaritmico, una retta è quindi un indicatore immediato del fatto che le cellule stanno crescendo in modo esponenziale. Una delle caratteristiche della crescita esponenziale è che l'incremento del numero di cellule è piccolo nella fase iniziale, ma aumenta sempre di più al passare del tempo. Ciò significa che, negli ultimi stadi, l'aumento del numero di cellule è esplosivo. Calcolo del tempo di generazione In microbiologia, molte volte è utile conoscere il tempo di generazione di una popolazione batterica durante la crescita esponenziale; questa informazione può essere ricavata dall'analisi dei dati relativi al numero di cellule, come quelli riportati nella Figura precedente. L`aumento del numero di cellule durante la crescita esponenziale di una coltura batterica non è altro che una progressione geometrica in base 2. La duplicazione di due cellule a quattro cellule può essere espressa come ; la duplicazione di quattro cellule a otto sarà , e così via. Proprio per questa progressione geometrica, esiste una relazione diretta tra il numero di cellule presenti inizialmente in una coltura e il numero di cellule presenti dopo un certo periodo di crescita esponenziale: N = N 0 2 n dove N = numero finale di cellule, No = numero iniziale di cellule, e n = numero di generazioni nel periodo di crescita esponenziale. Il tempo di generazione, g, della popolazione cellulare viene calcolato come t/n, dove t è il tempo in ore o minuti di crescita esponenziale. Quindi, conoscendo il numero iniziale e finale di cellule in una popolazione in crescita esponenziale, è possibile ricavare n, e conoscendo t è possibile ricavare il tempo di generazione, g. Per esprimere l'equazione N = N 0 2 n in funzione di n, sono necessarie le seguenti trasformazioni: N = N 0 2 n logn =logn O + nlog2 LogN - logn O = nlog2 n = log(n) - log(n O ) 0,301 n = log(n) - log(n O ) log 2

3 Avendo espresso n in funzione di quantità facilmente misurabili, N e N O, è possibile calcolare il tempo di generazione. Per esemplificare come eseguire questo calcolo, possiamo utilizzare i dati riportati nella parte bassa del grafico della Figura sotto. Il tempo di generazione di 2 ore, che in questo caso era stato ricavato direttamente dal grafico, può essere anche calcolato sapendo che N = 10 8, No = 5 x 10 7, e t = 2. Quindi: n = log (10 8 ) - log (5 x 10 7 ) 0, ,69 = 1 0,301 Di conseguenza, il tempo di generazione (t/n) = 2/1 = 2. Conoscendo n e t è possibile calcolare g per diversi microrganismi durante la crescita esponenziale in diverse condizioni colturali. Il tempo di generazione nella ricerca microbiologica è spesso utile per ottenere indicazioni sullo stato fisiologico di una popolazione di cellule e può essere usato per verificare l'effetto positivo o negativo di un trattamento su una coltura batterica. Inoltre, conoscendo il tempo di generazione di un batterio e il numero di cellule originariamente presenti, è possibile ottenere una popolazione con numero di cellule noto semplicemente incubando la coltura per un determinato periodo di tempo. E, quindi, possibile ottenere facilmente cellule in piena fase esponenziale di crescita (cosa spesso necessaria per lo studio di enzimi o di altre componenti cellulari) conoscendo il tempo di generazione della coltura in determinate condizioni colturali. Misurazione della crescita La crescita di una popolazione batterica viene misurata seguendo nel tempo la variazione del numero di cellule o della massa cellulare. Esistono parecchi metodi per contare il numero delle cellule o per stimare la massa cellulare; la scelta del metodo da utilizzare dipende dal tipo di microrganismo e dal problema che si intende affrontare. Conta totale Il numero di cellule di una popolazione può essere misurato contando le cellule al microscopio, un metodo chiamato conta diretta. Sono possibili due tipi di conta diretta: con campioni essiccati su un vetrino o con campioni in liquido. Con campioni in liquido devono venire usate delle speciali camere di conta. Nelle camere di conta, sulla superficie del vetrino è inciso un reticolo quadrettato di cui è nota l'area di ogni riquadro (vedi figura). Dato che lo spessore tra il reticolo e il vetrino coprioggetto è noto, è possibile conoscere il volume di sospensione batterica contenuta In ogni riquadro. Al microscopio, si conta il numero di cellule presenti in ogni riquadro del reticolo e questo valore viene convertito in

4 numero di cellule per millilitro di sospensione semplicemente moltiplicandolo per un fattore di conversione basato sul volume della camera (Figura). La conta diretta al microscopio è un modo rapido per stimare il numero di cellule ma presenta alcuni limiti: (1) (1) Non è possibile distinguere le cellule vive dalle cellule morte. (2) (2) E` difficile distinguere cellule di dimensioni molto piccole, pertanto un certo numero di cellule potrebbero non venire contate. (3) (3) E` difficile ottenere stime precise. (4) (4) Quando il campione non è stato colorato è necessario utilizzare un microscopio a contrasto di fase. (5) (5) Il metodo è inadatto per sospensioni a bassa densità cellulare; se la sospensione contiene meno di 10 6 batteri per millilitro nel campo del microscopio si osserveranno pochissime cellule o addirittura nessuna. Conta vitale Nel metodo appena descritto si contano sia le cellule vive che le cellule morte. In alcuni casi si è invece interessati a contare solo le cellule vive; a questo scopo sono stati sviluppati i metodi per la conta vitale. Si definisce vitale (viable) una cellula capace di dividersi e dare progenie; il metodo usuale per ottenere una conta vitale consiste nel determinare il numero di cellule presenti In un campione capaci di formare colonie su un opportuno terreno agarizzato. Per questo motivo la conta vitale viene anche chiamata conta in piastra o conta delle colonie. Il presupposto di questo tipo di procedura è che ogni colonia sia originata da una singola cellula vitale. Vi sono due metodi per attuare una conta in piastra: Il piastramento in superficie e il piastramento per inclusione (vedi Figura ). Nel piastramento in superficie, un volume noto di solito 0, 1 ml o meno, di una coltura opportunamente diluita viene distribuito sulla superficie di una piastra di terreno agarizzato con una spatola di vetro sterile. La piastra viene incubata fino alla comparsa delle colonie, che vengono quindi contate. E importante che la superficie della piastra sia piuttosto asciutta in modo che il liquido si adsorba. Solitamente si evita di usare volumi maggiori di 0, 1 ml per evitare che il liquido in eccesso non si adsorba e possa provocare la fusione di colonie diverse rendendo difficile il conteggio. Nel piastramento per inclusione (vedi Figura ), un volume noto (di solito 0,1-1,0 ml) di coltura viene pipettato in una capsula petri sterile; viene poi aggiunto il terreno agarizzato fuso e il tutto viene mescolato facendo ruotare gentilmente la piastra sul piano del tavolo. Poiché il campione viene mescolato con il terreno agarizzato fuso è possibile utilizzare un volume maggiore di quello usato nel piastramento in superficie; tuttavia usando questo metodo è necessario essere certi che l'organismo che deve essere incluso nell'agar sia in grado di sopportare per breve tempo la temperatura dell'agar fuso, 45ºC. In entrambe le tecniche è importante che il numero di colonie che si sviluppano su una piastra non sia troppo elevato, poiché un eccessivo affollamento Impedisce ad alcune cellule di formare colonie e il conteggio sarebbe quindi sottostimato. Inoltre è anche essenziale che il numero di colonie non sia troppo piccolo. altrimenti la significatività. statistica del numero di cellule così calcolato sarebbe troppo bassa. La pratica corrente, che è quella statisticamente più valida, consiste nel contare le colonie solo nelle piastre che contengono un numero di colonie compreso tra 30 e 300. Per ottenere un numero di colonie appropriato per il conteggio, il campione che deve essere contato deve quasi sempre venire diluito. Poiché raramente si conosce in anticipo, anche approssimativamente, il numero delle cellule vitali, è solitamente necessario effettuare più di una diluizione. Comunemente, si utilizza una serie di diluizioni scalari in base dieci (Figura)

5 . Per ottenere una diluizione di dieci volte (10-1 ) si possono mescolare 0,5 ml di campione con 4,5 ml di diluente, oppure 1,0 ml di campione con 9 ml di diluente. Se è necessaria una diluizione di cento volte (10-2 ), si possono mescolare 0,05 ml di campione con 4,95 ml di diluente, oppure 0, 1 ml di campione con 9,9 ml di diluente. Alternativamente, è possibile ottenere una diluizione per cento (10-2 ) facendo due successive diluizione per dieci. Nella maggior parte dei casi è necessario effettuare diluizioni seriali di questo tipo per ottenere la diluizione finale desiderata. Per ottenere una diluizione 10-6 (1/10-6 ) si possono quindi fare tre diluizioni successive 10-2 oppure sei diluizione successive Per definire più chiaramente il tipo di risultato, la conta vitale viene spesso espressa come numero di unità formanti colonia (cfu, colony-forming units) ottenute, piuttosto che come numero di cellule vitali (in quanto una unità formante colonia può essere costituita da una o più cellule). Nonostante le imprecisioni intrinseche implicite di una conta vitale, questa tecnica permette di trarre, relativamente al numero di cellule vitali, le migliori informazioni possibili ed è quindi ampiamente utilizzata. Nella microbiologia alimentare, casearia, medica e delle acque, questa tecnica viene usata di routine. Il metodo ha il vantaggio di essere molto sensibile: dato che possono essere contati campioni contenenti pochissime cellule è possibile individuare anche una contaminazione microbica di piccola entità nei materiali in esame. Inoltre, utilizzando terreni colturali altamente selettivi è possibile contare solo particolari gruppi di microrganismi all'interno di una popolazione mista. Massa cellulare In molti studi, è più conveniente stimare la massa delle cellule di una coltura piuttosto che il loro numero. La massa netta può essere misurata centrifugando le cellule e pesando la massa cellulare privata del terreno. Il peso secco si misura disidratando la massa cellulare ottenuta per centrifugazione prima di pesarla; di solito la disidratazione viene ottenuta ponendo la massa cellulare In una stufa a ºC per una notte. Generalmente il peso secco delle cellule batteriche si aggira Intorno al 10-20% del peso umido della massa cellulare. Un metodo semplice e molto utile per ottenere una stima relativa della massa cellulare consiste nell'effettuare misure di torbidità. Una sospensione cellulare appare torbida perché ogni cellula riflette la luce. Quanto maggiore è il numero di cellule presenti, tanto più la sospensione riflette la luce e tanto maggiore è la torbidità. La torbidità viene misurata con uno strumento chiamato colorimetro o con uno spettrofotometro. Con lo spettrofotometro la torbidità viene espressa come unità di assorbanza. Per gli organismi unicellulari l'assorbanza è (entro certi limiti) proporzionale sia al numero delle cellule che alla massa cellulare e quindi una determinazione della torbidità può essere usata in sostituzione del conteggio. Per ottenere il numero delle cellule partendo da una misura di torbidità, è necessario aver prima preparato una curva standard per ogni microrganismo studiato, che metta in relazione il numero di cellule (ottenuto per conta diretta al microscopio o per conta vitale) con la massa cellulare o con l'assorbanza. La torbidità è un modo di misurare la densità cellulare molto meno sensibile della conta vitale. ma ha il vantaggio di essere un metodo rapido, facile e che non danneggia o distrugge il campione. Questo tipo di misurazioni sono largamente utilizzate per seguire la crescita di una coltura in quanto lo stesso campione può essere misurato ripetutamente. Ciclo di crescita di una popolazione batterica I dati presentati nella Figura che indicava la velocità di crescita illustrano soltanto una parte dei ciclo di crescita di una popolazione batterica. Una tipica curva di crescita di una popolazione

6 batterica è illustrata nella Figura sopra. Una curva di crescita dei tipo illustrato può essere suddivisa in diverse fasi tra loro distinte. chiamate fase di latenza. fase esponenziale, fase stazionaria e fase di morte. Fase di latenza Quando una popolazione batterica viene inoculata in un terreno fresco, di solito la crescita non inizia immediatamente, ma soltanto dopo un certo periodo di tempo chiamato fase di latenza (o fase "lag"); questo periodo può essere più o meno breve a seconda delle condizioni. Se una coltura in fase esponenziale viene inoculata nello stesso terreno mantenendo inalterate tutte le condizioni colturali, non vi è fase di latenza e la crescita esponenziale continua alla stessa velocità. Al contrario, se l'inoculo viene prelevato da una coltura in fase stazionaria e inoculata nello stesso terreno, solitamente si osserva una fase di latenza anche se tutte le cellule dell'inoculo sono vitali. Ciò è dovuto al fatto che, solitamente, cellule vecchie non contengono una quantità ottimale di coenzimi o di altri costituenti cellulari essenziali per la crescita, e necessitano, quindi, di un certo tempo per sintetizzarli nuovamente. Si determina una fase di latenza anche quando l'inoculo è costituito da cellule che siano state danneggiate (ma non uccise) da trattamenti con calore, radiazioni o composti chimici tossici, in quanto le cellule devono avere il tempo necessario per riparare il danno subito. La fase di latenza si osserva anche quando una popolazione viene trasferita da un terreno colturale ricco ad uno più povero. Ciò è dovuto al fatto che, per poter crescere in un determinato terreno di coltura, le cellule devono essere dotate di tutti gli enzimi necessari alla sintesi dei metaboliti essenziali che non sono presenti nel terreno stesso (p.e. aminoacidi); di conseguenza, cellule trasferite in terreno più povero di quello in cui sono cresciute richiedono un certo periodo di tempo per la sintesi di nuovi enzimi. Fase esponenziale La fase di crescita esponenziale è già stata discussa. Come è stato detto, la fase esponenziale è una conseguenza del fatto che ogni cellula si divide a dare due nuove cellule figlie. che a loro volta si duplicheranno a darne quattro, e così via. La maggior parte dei microrganismi unicellulari cresce in modo esponenziale, ma la velocità della crescita esponenziale può variare molto. Per esempio, l'agente patogeno della febbre tifoide, Salmonella typhi, cresce in coltura molto rapidamente, con un tempo di generazione di minuti, mentre l'agente della tubercolosi, Mycobacterium tubercolosis, cresce lentamente, duplicandosi solo una o due volte al giorno. La velocità della crescita esponenziale è influenzata sia dalle condizioni ambientali (temperatura, composizione del terreno colturale) che dalle caratteristiche genetiche del microrganismo stesso. In generale, i microrganismi procariotici crescono più rapidamente degli eucarioti, e gli eucarioti di piccole dimensioni crescono più velocemente di quelli di dimensioni maggiori. Fase stazionaria In un sistema chiuso, la crescita esponenziale non può continuare per un tempo indefinito. Una singola cellula batterica con un tempo di generazione di 20 minuti produrrebbe, se continuasse a crescere in modo esponenziale per 48 ore, una popolazione il cui peso sarebbe circa 4000 volte il peso della terra, dato particolarmente impressionante se si considera che il peso di una singola cellula batterica è circa g. Ovviamente, devono esistere dei meccanismi che limitano la crescita della popolazione molto prima di arrivare a questo punto. Generalmente, il termine della fase esponenziale è determinato o dall'esaurimento di un nutriente essenziale del terreno colturale o dall'accumulo, fino a livelli inibitori, di prodotti di rifiuto escreti dall'organismo. La popolazione ha quindi raggiunto la fase stazionaria.

7 Durante la fase stazionaria non vi è né un incremento né un decremento netto del numero di cellule. Comunque, sebbene durante la fase stazionaria non vi sia crescita netta, molte funzioni cellulari, come il metabolismo energetico e alcuni processi biosintetici, continuano. Alcuni metaboliti, chiamati metaboliti secondari, vengono prodotti soprattutto durante la fase stazionaria, in particolare durante il periodo di transizione tra la tarda fase esponenziale e la fase stazionaria. Tra i più importanti metaboliti secondari ricordiamo gli antibiotici (per esempio, penicillina e streptomicina) e alcuni enzimi di interesse industriale. In alcuni microrganismi si può avere una certa crescita durante la fase stazionaria; in questo caso alcune cellule della popolazione crescono mentre altre muoiono, i due processi sono bilanciati in modo tale che non vi è né un aumento né una diminuzione netta del numero di cellule (questo fenomeno viene chiamato crescita criptica). Nei batteri sporigeni, l'endospora viene prodotta solo quando la coltura entra in fase stazionaria. Studi condotti con Escherichia coli hanno permesso di identificare diversi geni necessari alla sopravvivenza delle cellule che sono entrate in fase stazionaria. La funzione di alcuni di questi geni, chiamati geni sur (da "survival" = sopravvivenza), non è ancora stata identificata, ma è noto che mutazioni nei geni sur determinano una rapida morte delle cellule non appena entrano in fase stazionaria. Tra i geni specifici della fase stazionaria vi sono geni che codificano specifici fattori sigma della RNA polimerasi, necessari per la trascrizione di geni espressi solo durante questa fase di crescita, e geni che codificano proteine che in qualche modo proteggono le cellule ormai vecchie da danni ossidativi. Poiché è molto probabile che. in ambienti naturali, molte cellule batteriche non siano in crescita esponenziale o che stiano crescendo molto lentamente, non deve sorprendere che si siano evoluti geni che permettono ad una cellula di affrontare le condizioni poco favorevoli in cui si trova quando la popolazione ha raggiunto la fase stazionaria o quando, per diversi motivi, la popolazione sta crescendo con estrema lentezza. Fase di morte Se l'incubazione prosegue dopo che la popolazione ha raggiunto la fase stazionaria, le cellule possono sopravvivere e continuare il loro metabolismo o possono morire. Quando le cellule cominciano a morire si dice che sono entrate nella fase di morte. Durante la fase di morte la conta totale (misurata come conta diretta al microscopio) può rimanere costante, ma la conta vitale diminuisce lentamente. In alcuni casi. la morte è accompagnata dalla lisi cellulare, che determina una diminuzione del numero di cellule contate direttamente al microscopio e della torbidità, in concomitanza con il decremento della conta vitale. E` necessario sottolineare che le diverse fasi della curva di crescita di una popolazione batterica sono il risultato di eventi che interessano tutta la popolazione e non una singola cellula. I termini fase di latenza, fase esponenziale, fase stazionaria, o fase di morte non sono applicabili alle singole cellule ma soltanto a popolazioni di cellule.