Le colture batteriche. Pievesestina 2010

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Nicoletta Gatto
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1 Le colture batteriche Pievesestina 2010

2 La riproduzione batterica: moltiplicazione cellulare

3 La curva di crescita batterica: le fasi Numero di batteri Fase stazionaria Fase logaritmica di crescita Fase di morte Fase lag Inoculo iniziale Tempo

4 La curva di crescita batterica: la durata La durata della curva e delle varie fasi dipende dal tempo di generazione Batteri a rapida crescita: tempo di generazione 20 minuti curva ore Batteri a lenta crescita Tempo di generazione alcune ore Curva da 48 ore a diversi giorni o settimane

5 Riproduzione batterica: la coltura batterica Se le cellule si raggruppano, ciascuna sarà in grado di sopravvivere e genererà una colonia isolata. Colonie di microrganismi diversi differiscono per misura, colore e struttura. Per questo motivo l aspetto di una colonia è importante per l identificazione di una coltura.

6 Aspetto macroscopico delle colonie Forma Rilievo puntiforme d < 1 mm effuso sottile, allungato circolare piatto filamentosa irregolare, a filo intrecciato sopraelevato rizoide irregolare, ramificata convesso irregolare umbonato

7 Aspetto macroscopico delle colonie Superficie Margine liscia intero rilevata ondulata ondulato radiata eroso concentrica anelli concentrici filamentoso rugosa raggrinzita arricciato

8 Fattori influenzanti la crescita Sostanze nutritive Temperatura ph Pressione Concentrazione salina Pressione osmotica

9 Fattori influenzanti la crescita Le sostanze nutritive Come tutti gli organismi i batteri crescono assumendo materiale dall ambiente mediante la nutrizione e trasformandolo in modo da ottenere tutti i composti necessari alla loro sopravvivenza Reazioni degradative:catabolismo Reazioni sintetiche: anabolismo

10 Fattori influenzanti la crescita Le sostanze nutritive Batteri autotrofi se sono in grado di svolgere da soli tutti i processi di sintesi partendo da materiale inorganico; Batteri eterotrofi che richiedono invece l assunzione di alcuni composti organici preformati

11 Fattori influenzanti la crescita Temperatura La maggior parte dei batteri cresce in un intervallo termico di circa 20 C, esibendo la massima velocità di crescita ad un certo optimum termico Psicrofili: ~0 20ºC Mesofili: ~10 50ºC Termofili: ~40 75 ºC Ipertermofili: ~ ºC

12 Fattori influenzanti la crescita Temperatura

13 Fattori influenzanti la crescita ph Acidofili: Crescono al di sotto di ph 6 (generalmente a ph 2 6) Funghi e lieviti (ph 5-6) Neutrofili: Crescono tra ph 6 8 Maggior parte dei batteri Alcalofili: Crescono sopra ph 8 (generalmente a ph 8 9.5)

14 Fattori influenzanti la crescita Concentrazione salina (pressione osmotica) Alofili: Crescono ad elevate concentrazioni saline (generalmente 1 M), sopportando elevate pressioni osmotiche; Stafilococchi

15 Fattori influenzanti la crescita Atmosfera di incubazione Presenza o assenza di Ossigeno Aerobi obbligati Anaerobi Microaerofili

16 Fattori influenzanti la crescita Ossigeno (O 2 ) Aerobi obbligati Aerobi facoltativi Anaerobi obbligati Anaerobi facoltativi Microaerofili

17 Anaerobiosi Giara per anaerobiosi Figure 6.5

18 Anaerobiosi Cappa (camera) anaerobica Figure 6.6

19 Carbossifilia Candle jar CO 2 -packet

20 Terreni di coltura Terreno di coltura: mezzo nel quale o sul quale può avvenire lo sviluppo e la crescita in vitro di un microrganismo Caratteristiche: concentrazione adatta di sostanze nutritive per la crescita batterica adeguato grado di umidità reazione (ph) adatta sterili e protetti da qualsiasi inquinamento

21 Terreni di coltura:contenuto qualitativo Peptoni: insieme di composti idrosolubili, ottenuti per idrolisi (acida od enzimatica) delle proteine (caseina, soja, ecc.) NaCl: aggiunto in concentrazioni adeguate per le necessità osmotiche richieste da alcuni batteri Zuccheri: glucosio, lattosio, mannite, sono aggiunti per scopi specifici in terreni particolari Estratti di lievito, carne, d organo: forniscono fattori di crescita e sali inorganici

22 Terreni di coltura: Contenuto qualitativo Arricchimenti: sangue lisato, emoglobina, latte disidratato, gelatina vitamine. Necessari per la crescita di batteri più esigenti dal punto di vista nutrizionale Supplementi selettivi: specifici (antibiotici) od a spettro meno definito (sali biliari, cristalvioletto, sodio-azide) Indicatori: le sostanze coloranti (fenolo, blu di bromo fenolo, rosso fenolo, verde di bromo cresolo, ecc.) permettono di seguire il metabolismo fermentativo del batterio in esame, determinando il viraggio di colore del terreno a valori critici di ph

23 Terreni di coltura: Classificazione In base allo stato fisico: Terreni LIQUIDI: componenti sciolti in acqua e sterilizzati. Terreni SOLIDI: possono essere naturalmente tali (terreno alla patata) o vengono solidificati per aggiunta di un agente gelificante (agar, gelatina, silica-gel)

24 Terreni di coltura: Classificazione In base alla costituzione chimica: Terreni MINIMI: per la crescita dei soli batteri autotrofi. Gli elementi essenziali (N, C, S, P) sono presenti come sali inorganici in composizione e quantità note. Terreni SINTETICI (o Definiti): nota la formulazione chimica di ogni ingrediente; le singole sostanze di cui il batterio necessita sono presenti in quantità note. Terreni COMPLESSI: ignota l esatta composizione chimica delle sostanze nutritive (estratto di carne di bue, cuore, cervello, ecc.). Comprendono la maggior parte dei terreni usati in laboratorio.

25 Terreni di coltura: Classificazione In base alla funzione: Terreni di ARRICCHIMENTO (o ELETTIVI): la specie microbica di interesse vi cresce in un tempo assai più breve rispetto ad altre specie microbiche. Terreni SELETTIVI: contengono sostanze batteriostatiche (sali biliari, tellurito di K, NaCl, azide sodica, cetrimide, cristalvioletto) a concentrazione nota che inibiscono o rallentano lo sviluppo di molte specie microbiche, ma non di altre. Utilizzati per l isolamento di specifici microrganismi da campioni altamente contaminati. Terreni DIFFERENZIALI (o cromogeni): contengono sostanze indicatrici di particolari reazioni biochimiche che avvengono nel terreno stesso. Usati per la ID di specifici microrganismi.

26 Terreni di coltura: Criteri di scelta In base al tipo di materiale da seminare: Per campioni provenienti da distretti sterili: sempre terreni di arricchimento e terreni generici molto nutrienti e poco selettivi. L aggiunta di terreni cromogeni o selettivi agevola l identificazione presuntiva delle colonie Per campioni provenienti da distretti NON sterili: sempre terreni selettivi per agevolare l identificazione degli eventuali patogeni presenti. L aggiunta dei terreni generici consente di giudicare la normalità della popolazione microbica del distretto

27 Terreni di coltura TECNICA ASETTICA Quando si manipolano campioni o culture, la tecnica asettica risulta importante per evitare la loro contaminazione e proteggere chi lavora da infezione proveniente dal campione Quando si aprono i contenitori delle culture mantenere il campioni lontano dal viso

28 Terreni di coltura Tecniche di semina per isolamento TECNICA DELLA STRISCIATA SU PIASTRA Si trasferisce il materiale (con ansa o tampone) sulla superficie dell agar di una piastra Petri. Questa tecnica viene chiamata di semina per striscio ed una piastra così preparata viene detta strisciata. Esistono varie tecniche di striscio su piastra. L obiettivo della tecnica dello striscio è quella di formare da una sospensione di cellule, delle colonie ben separate.

29 Terreni di coltura Tecniche di semina per isolamento Poche strisciate frettolose non producono colonie separate; una buona piastra è il risultato di molti movimenti continui dell ansa. Nelle semine da mezzo liquido si inizia deponendo una goccia (con ansa) vicino al bordo della piastra. La goccia deve essere opposta a voi Strisciate verso di voi All inizio di una striscio le cellule sono strettamente compatte, ma con il proseguire lo striscio le cellule rimangono sempre meno sull ansa, trasferendosi sempre più distanziate sull agar formando colonie sempre più separate.

30 Terreni di coltura Tecniche di semina per isolamento L area iniziale di semina deve ricoprire una superficie compresa fra un terzo ed un quarto dell area complessiva dell agar utilizzato. Possono essere utilizzate in funzione delle circostanze piastre intere, a metà od a quattro settori.

31 Terreni di coltura Tecniche di semina per isolamento Tutti i terreni devono essere incubati il più presto possibile ad unatemperatura, per un TEMPO e nelle CONDIZIONI ottimali per permettere la crescita del microrganismo con cui si sta lavorando Le piastre per l incubazione anaerobica devono essere incubate il più presto possibile per prevenire la perdita di vitalità Le piastre vanno incubate in posizione capovolta Scrivere SU TUTTE LE PIASTRE nome, data e tipo di contenuto o apporre etichette relative

32 Terreni di coltura Tecniche di semina per isolamento

33 Terreni di coltura Tecniche di semina per isolamento

34 Semina per isolamento

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