Metodi di studio dei batteri

Транскрипт

1 Metodi di studio dei batteri

2 Esame microscopico

3 Microscopia ottica Campo chiaro campo scuro contrasto di (luce diffratta o diffusa) fase (indice di rifrazione)

4 Esame microscopico Preparazione in sol. Fisiologica Metodo della goccia pendente Esame allo stato vivente Colorazione semplice Colorazioni differenziali Esame previa fissazione

5 Preparazione in sol. Fisiologica

6 Metodo della goccia pendente

7 Preparazione in inchiostro di china (colorazione della capsula)

8 Colorazione di Gram

9 Colorazioni per l acido-alcool resistenza Colorazione di Kinyoun Colorazione di Ziehl-Neelsen Colorazione con auramina

10 Colorazioni in fluorescenza Utilizzo di fluorocromi: una molecola fluorescente emette luce ad una lunghezza d onda superiore rispetto a quella della luce su essa incidente. Es: fluoresceina (verde), propidio (rosso)

11 Tecniche Colturali

12 Tecniche di inoculazione

13 Terreni di coltura Isolamento degli agenti patogeni causa di infezione Isolamento e conta dei microgranismi Identificazione dei microrganismi Mantenimento in coltura Test di sensibilità agli antimicrobici Studio delle caratteristiche biochimiche, fisiologiche, ecc Valutazione dell attività biologica di preparati farmaceutici

14 Terreni di coltura (2) LIQUIDI SOLIDI (BRODI) (1-2% Agar) Terreni universali Terreni di arricchimento o elettivi: brodi che favoriscono la crescita più rapida di un particolare microrganismo che altrimenti verrebbe sopraffatto da altri batteri presenti in una miscela microbica Terreni selettivi: contengono particolari sostanze capaci di inibire la crescita di alcuni batteri favorendo lo sviluppo di altri Terreni differenziali: contengono indicatori che consentono di distinguere tra loro microrganismi differenti, sfruttando il diverso aspetto delle colonie, dopo crescita su terreni solidi

15 Principali componenti dei terreni di coltura (1) Nutrienti: proteine, peptidi, aminoacidi Energetici: carboidrati (glucosio) Metalli e minerali essenziali Agenti tamponanti: fosfati, acetati (ph) Indicatori di variazione del ph: rosso fenolo, bromo-cresol porpora, fucsina, ecc. Mettono in evidenza la fermentazione di specifici carboidrati in un terreno colturale cambiando di colore in maniera netta e rapida a valori critici di ph

16 Principali componenti dei terreni di coltura (2) Agenti selettivi: agenti chimici (sali biliari, coloranti, ecc.) o antimicrobici (poiché termolabili, vanno aggiunti dopo sterilizzazione) Sostanze gelificanti: agar. Caratteristiche: inerzia nei confronti dei batteri, particolari temperature di solidificazione e di fusione (38 C e 84 C), scarsa tossicità, trasparenza Altri componenti: fattori di crescita per i microrganismi particolarmente esigenti (Es: fattori V e X per Haemophilus influenzae),

17 Condizioni di incubazione Temperatura ottimale: i batteri patogeni sono mesofili con un optimum intorno ai 36 C Concentrazione di CO 2 : nel caso dei microaerofili deve essere del 10% Presenza di ossigeno per i batteri aerobi Eliminazione dell ossigeno per la coltura degli anaerobi obbligati: l aria viene sostituita con un gas inerte (azoto) o dove l ossigeno viene eliminato mediante particolari reazioni chimiche.

18 SVILUPPO DEI BATTERI IN TERRENI LIQUIDI -Latenza -Fase esponenziale o logaritmica (coltura giovane) -Fase di decelerazione della crescita -Fase stazionaria (coltura vecchia) -Fase di morte o fase di declino Colture continue: Chemostato (sottrazione continua del terreno invecchiato e continua aggiunta di un eguale quantità di terreno fresco)

19 I microrganismi ad occhio nudo: crescita in substrati liquidi

20 SVILUPPO DEI BATTERI IN TERRENI SOLIDI Inoculati alla superficie di un terreno gelificato con agar i batteri possono crescere formando una patina o colonie isolate a seconda della quantità di inoculum originale. Colonie S (da smooth = liscio): sono lisce, di consistenza cremosa Colonie R (da rough = rugoso): sono più secche, con superficie rugosa e margini frastagliati. Colonie mucose: capsula abbondante COLTURE DI MANTENIMENTO Temperature inferiori a quelle ottimali, dopo che lo sviluppo batterico ha raggiunto l inizio della fase stazionaria Essiccamento in liquidi ricchi di sostanze proteiche o liofilizzazione

21 ESEMPI DEI PIU COMUNI TERRENI DI COLTURA Mueller Hinton Agar: Terreno raccomandato per i test di sensibilità agli antibiotici (metodo di Kirby-Bauer)

22 ESEMPI DEI PIU COMUNI TERRENI DI COLTURA 3 CLED Medium (Cystine Lactose Electrolyte - Deficient): agar per colture su piastra di microrganismi urinari. Per lo scarso contenuto di elettroliti, impedisce la diffusione del Proteus.

23 ESEMPI DEI PIU COMUNI TERRENI DI COLTURA Agar sangue: all agar base [estratto di carne, peptone, sodio cloruro] può essere aggiunto: Sangue defibrinato di cavallo (Haemophilus influenzae) Sangue defibrinato di montone (Streptococchi beta emolitici) Sangue defibrinato umano (Gardnerella vaginalis; no streptococchi) Sangue ossalato di cavallo (satellitismo)

24

25 ESEMPI DEI PIU COMUNI TERRENI DI COLTURA (4) MacConkey Agar N.3: Terreno selettivo per differenziare in modo ottimale i coliformi (color rosso violetto) ed i batteri non fermentanti il lattosio (incolori). I sali biliari ed il cristal violetto inibiscono totalmente i Gram-positivi

26 Salmonella Shigella Agar (SS): è un terreno selettivo e differenziale, indicato per l isolamento di Salmonella dalle feci e da altri campioni. Shigella ed altri microrganismi crescono dando colonie piccole incolori con centro nero per la precipitazione di solfato di ferro indotta dalla produzione di idrogeno solforato a partire dal tiosolfato sodico presente nel terreno.

27 ESEMPI DEI PIU COMUNI TERRENI DI COLTURA (5) Cetrimide Agar: Terreno selettivo per l isolamento e l identificazione presuntiva di Pseudomonas aeruginosa. Il cloruro di magnesio e il solfato di potassio sono aggiunti per stimolare la produzione di pigmento e la cetrimide inibisce la crescita della maggior parte dei microrganismi, esclusa Pseudomonas aeruginosa

28 Mannitol Salt Agar: E un terreno selettivo preparato secondo i suggerimenti di Chapman per l isolamento di stafilococchi presunti patogeni.

29 ESEMPI DEI PIU COMUNI TERRENI DI COLTURA (6) Bile Esculina Agar:[peptone, sali biliari, citrato ferrino, esculina, agar] Terreno differenziale per l isolamento e l identificazione presuntiva degli Enterococchi.

30 Sabouraud Dextrose Agar: [peptone micologico, destrosio, agar, ev. penicillina, streptomicina, cicloeximide, cloramfenicolo]. Terreno acido indicato per l isolamento di dermatofiti e di altri funghi e lieviti

31 Agar cioccolato

32 Terreno selettivo per Micobatteri Lowenstein-Jensen

33 Identificazione mediante prove biochimiche Antibiogramma Microbiologia molecolare

34 Disinfezione Sterilizzazione

35 Disinfezione e Sterilizzazione DISINFEZIONE Qualsiasi procedimento che si prefigga la uccisione di microrganismi patogeni presenti nell ambiente STERILIZZAZIONE Qualsiasi procedimento che si prefigga la distruzione di tutti i microrganismi (patogeni e non) presenti in un determinato materiale

36 DISINFEZIONE MECCANISMI dei DISINFETTANTI Denaturazione delle proteine (formaldeide, glutaraldeide, ossido di etilene) Ossidazione di enzimi (perossidi, cloro, ipocloriti, iodio) Alterazione delle membrane (alcooli, fenoli, composti dell ammonio quaternario, clorexidina)

37 DISINFEZIONE SCELTA dei DISINFETTANTI Concentrazione attiva Tossicità Danneggiamento del substrato da disinfettare Presenza nel substrato di inibitori del disinfettante Tempo minimo di applicazione

38 Sterilizzare materiali e substrati La sterilizzazione (eliminazione di tutti gli organismi viventi) può essere ottenuta: con metodi fisici calore secco umido radiazioni UV raggi g filtrazione con metodi chimici ossido di etilene La scelta del metodo di sterilizzazione dipende dal materiale da trattare

39 La sterilizzazione con calore. Il calore è da sempre uno dei mezzi più utilizzati per la sterilizzazione. E possibile usare: calore secco (per vetreria, strumenti in metallo): in stufa a circolazione d aria, con il materiale avvolto in fogli di alluminio, carta speciale o in contenitori: 170 C, 90 min o 180 C, 60 min. calore umido (per substrati, vetreria, materiali in plastica): in autoclavi verticali o orizzontali: 121,1 C (1 atm. Di pressione) per min. Tempi e temperature di trattamento sono più ridotti nella sterilizzazione con calore umido perché: i microrganismi in forma essiccata sono più resistenti la trasmissione del calore è più efficace in vapore d acqua

40 Le autoclavi da laboratorio coperchio termostato manometro termometro cestello

41 La sterilizzazione per filtrazione Un filtro di profondità (a), un filtro in acetato di cellulosa tradizionale (b) e un filtro Nucleopore Microrganismi immobilizzati sulla superficie di un filtro

42 La sterilizzazione per filtrazione Supporto di filtrazione riutilizzabile in policarbonato Filtri da siringa Membrane in acetato di cellulosa Unità di filtrazione in linea in acciaio Unità di filtrazione in linea in policarbonato