IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA

Transcript

1 Calsystem

2 La determinazione del profilo biochimico di un microrganismo è il metodo più comunemente utilizzato per l identificazione microbiologica. Si tratta di test di facile esecuzione che utilizzano le tecniche della microbiologia classica e non prevedono l impiego di particolari attrezzature.

3 Il microrganismo da identificare viene coltivato su substrati diversi costituiti da fonti di carbonio specifici, verificando la capacità del microrganismo di utilizzarli e trasformarli. L insieme di queste informazioni traccia un profilo biochimico tipico di quell organismo che viene confrontato con i profili noti arrivando così alla sua identificazione.

4 FERMENTAZIONE DEI CARBOIDRATI Produzione di acidi e/o gas durante la crescita per la fermentazione degli zuccheri Terreno liquido con il carboidrato e un indicatore di ph (rosso fenolo) Differenziare gli enterobatteri

5 UTILIZZAZIONE DEL CITRATO La utilizzazione del citrato come unica fonte di carbonio determina una alcalinizzazione del terreno Terreno liquido con l aggiunta di citrato e un indicatore di ph (blu di bromotimolo) Differenziare Klebsiella o Enterobacter da Escherichia o Salmonella

6 DECARBOSSILASI La decarbossilasi di amminoacidi libera CO2 e ammine Terreno arricchito di amminoacidi (lisina, ornitina, arginina) con l indicatore Porpora di bromocresolo che vira al violetto se l enzima è attivo Determinare il gruppo batterico tra gli enterobatteri

7 B-galattosidasi (ONPG) La B-galattosidasi idrolizza lonpg l ONPG (o-nitrofenil-b- galattoside a nitrofenolo di colore giallo Terreno contenente ONPG. Se l enzima è presente il pozzetto vira al colore giallo Differenziare Citrobacter e Arizona (+) da Salmonella (-). Identificazione di alcune shigelle e Pseudomonas

8 LIQUEFAZIONE DELLA GELATINA Molti batteri posseggono proteasi e idrolizzano la gelatina Al brodo nutritivo si aggiunge gelatina al 12%. Se la gelatina è idrolizzata il terreno rimane liquido anche dopo raffreddamento. Aiuta nell identificazione di molti batteri enterici

9 PRODUZIONE DI H 2 S L idrogeno Lidrogeno solforato viene prodotto in seguito a degradazione di amminoacidi contenenti gruppi solforici o dalla riduzione del tiosolfato Il terreno viene arricchito con ferro che precipita come solfuro di ferro (nero) in caso di produzione di H 2 S. Aiuta nell identificazione di molti batteri enterici

10 INDOLO Il triptofano presente nelle proteine è convertito ad indolo La presenza di indolo è evidenziata dall aggiunta al terreno di dimetilaminobenzaldeide Permette di differenziare Escherichia (+) da Klebsiella /enterobacter

11 ROSSO METILE Batteri fermentanti che producono una miscela di acidi sufficiente ad abbassare il ph al di sotto di 4.3 Al terreno glucosato viene aggiunto dopo incubazione l indicatore Rosso Metile Permette di differenziare Escherichia (rossa) da Klebsiella /enterobacter (gialle)

12 RIDUZIONE DEL NITRATO Il nitrato può fungere da accettore di elettroni (respirazione anaerobia) riducendosi a nitrito o azoto Brodo nutritivo con nitrato. Dopo incubazione la presenza di nitriti i i è evidenziata i dall aggiunta di a-naftilammina/acido fil i id solfanilico che produce un colore rosso in presenza di nitriti Aiuta a differenziare molti batteri enterici di solito positivi

13 FENILALANINA DEAMINASI La deaminazione produce acido piruvico. Terreno arricchito in fenilalanina. Dopo la crescita l aggiunta di cloruro ferrico determina una colorazione verde Caratterizza il genere Proteus e il gruppo Providencia

14 IDROLISI DELL AMIDO La soluzione Iodio/iodurata (LUGOL) dà un colore blu in presenza di amido. I batteri sono fatti crescere in un terreno agarizzato contenente amido. Dopo incubazione si inonda la piastra con liquido di Lugol e si guarda la eventuale eetuaezona oadc di chiarificazione ca oeintorno oaecoo alle colonie Aiuta a identificare batteri capaci di idrolizzare l amido ad esempio Bacillus

15 UREASI L urea viene scissa in ammoniaca e CO2 Terreno contenente urea al 2% e fenolo come indicatore di ph Permette di distinguere Klebsiella(+) da Escherichia (-)

16 VOGES-PROSKAUER (VP) L acetoina Lacetoina viene prodotta dalla fermentazione dello zucchero Aggiunta del reattivo a-naftolo dopo incubazione. In caso di positività si sviluppa un colore rosso Permette di distinguere Klebsiella(+) e Enterobacter (+) da Escherichia (-). Caratterizza i ceppi di Bacillus

17 Questi metodi si sono evoluti nel tempo fino ad arrivare a sistemi semi-automatici, addirittura automatici, che permettono di effettuare contemporaneamente un elevato numero di prove biochimiche e confrontarle con database molto ampi, mediante codici numerici.

18 L identificazione di ogni e qualsiasi batterio richiederebbe un elevato numero di test biochimici di faticosa esecuzione e di difficile interpretazione. I pannelli (o gallerie) vengono organizzati a seconda dei gruppi batterici o lieviti da ricercare in funzione, intanto, dell origine del campione e in funzione di prove preliminari di orientamento.

19 Frequenza dei patogeni urinari i Escherichia coli 75% Gram Proteus 10% Gram Klebsiella Gram 90% Enterobacter 5% Gram Serratia Gram Staphylococcus 5% Gram + Streptococcus 3% Gram + Pseudomonas 2% Gram

20 Un pannello di identificazione per batteri urinari conterrà le prove biochimiche adatte a discriminare le specie elencate nella tabella precedente.

21 Questa procedura richiede, però, un pannello per ogni tipologia di campione per la probabilità diversa della presenza di una determinata specie. L orientamento attuale è di disporre di soli due pannelli con un numero più significativo di prove biochimiche (e non solo), uno per Grame uno per i Gram+. Un terzo pannello da dedicare esclusivamente ai lieviti ed ai funghi.

22 Prove preliminari di orientamento 1. Colorazione di Gram Discrimina i batteri in Gram+ e Gram- 2. Test KOH E alternativa alla colorazione di Gram. I lipidi presenti nella parete dei Gram- vengono disciolti dal KOH dando luogo ad una sostanza mucosa filante all ansa. I Gram+ non mostrano alcun cambiamento. 3. Catalasi La catalasi è un enzima capace di scindere l acqua ossigenata in acqua ed ossigeno. Per distinguere Staphylococcus (+) da Streptococcus (-) 4. Ossidasi La ricerca dell enzima citocromo-ossidasi si esegue aggiungendo una goccia di tetrametil-p-fenilendiammina sulla colonia o su una colonia trasferita su una striscia di carta. Si sviluppa un colore rosa>viola Serve a discriminare gli enterobatteri dagli Pseudomonas Serve a discriminare gli enterobatteri dagli Pseudomonas 5. Emolisi Per distinguere gli alfa dai beta-emolitici

23 L evoluzione dei sistemi ENTEROTUBE