NUTRIZIONE BATTERICA: crescita di un microrganismo Tutti gli organismi viventi per poter crescere devono trarre

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1 NUTRIZIONE BATTERICA: approvigionamento di sostanze nutritizie per la crescita di un microrganismo Tutti gli organismi viventi per poter crescere devono trarre dall ambiente le SOSTANZE NUTRITIZIE di cui hanno bisogno per il loro METABOLISMO METABOLISMO ENERGETICO o catabolismo Avviati nei processi DEMOLITIVI ELEMENTI NUTRITIZI METABOLISMO BIOSINTETICO o anabolismo PRODUZIONE DI ENERGIA (ATP) Attività cellulari Trasporto di membrana Movimento ecc. Avviati nei processi di SINTESI La cellula costruisce o restaura le proprie strutture Dott.. Esin TPALL 2009

2 TRE PRINCIPALI MECCANISMI DI PRODUZIONE DI ENERGIA NEI BATTERI 1) FERMENTAZIONE Processo di produzione di energia che non comporta una completa demolizione del substrato. Avviene in assenza di O 2 Substrati fermentabili: zuccheri, amino acidi, acidi organici E UN PROCESSO VELOCE, MA POCO EFFICIENTE: a parità di molecole di substrato si produce meno ATP 2) RESPIRAZIONE Completa demolizione del substrato ad H 2 O ed CO 2 Maggiore produzione di energia RESPIRAZIONE AEROBIA: AVVIENE IN PRESENZA DI O 2 di e-) (Accettore finale RESP. ANAEROBIA: l accettore finale di e- è un composto inorganico quale nitrito, carbonato, solfato. 3) FOTOSINTESI

3 SOSTANZE NUTRITIZIE -MACROELEMENTI (sostanze nutritive necessarie in notevole quantità) H 2 O: Rappresenta l 80-90% del peso totale della cellula ed è perciò sempre l elemento nutritizio fondamentale. Fonte di carbonio (C): È utilizzata per: -sintesi dei composti organici -produzione di energia A seconda di quale forma di Carbonio utilizzano, i microrganismi si distinguono in: - autotrofi (CO 2 ; carbonio inorganico) - eterotrofi (zuccheri, amido: carbonio organico) Fonte di azoto (N): È il costituente principale delle proteine (10% del peso secco dei batteri) Capacità di utilizzare varie forme di azoto - N atmosferico (pochi batteri) - N inorganico (sali di ammonio, NO 3, NO 2 ecc.) - N organico (a.a., peptoni, urea) O 2 : Esigenza e tolleranza molto diverse tra i batteri. Fosforo (P): Componente di acidi nucleici (DNA, RNA), fosfolipidi. Zolfo (S): Componente di alcuni aminoacidi (cisteina, metionina). Altri elementi: K, Mg, Ca, Na. Fattori di crescità organici: Fattori di crescità organici: Composti di cui il batterio ha assoluta necessità per il proprio accrescimento, ma che non è capace di sintetizzare. Devono essere forniti al batterio preformati. Le esigenze di fattori di crescita variano da batterio a batterio. -Amino acidi -Vitamine -Alcune purine o pirimidine -MICROELEMENTI (sostanze nutritive necessarie in piccole quantità) Mn, Cu, Zn, Fe

4 EFFETTO DELL OSSIGENO SULLA CRESCITA DEI BATTERI: esigenze e tolleranze molto diverse 1) ANAEROBI: non sono dotati di una catena di trasporto degli elettroni (e-) e non possono utilizzare l O 2 come accettore finale di elettroni ANAEROBI TOLLERANTI (FACOLTATIVI): La loro crescita non è migliore in presenza di O 2. Tollerano l O 2, ma anche in presenza di aria producono energia tramite la fermentazione. (Es.. Batteri dell acido lattico (Streptococchi, Stafilococchi); ANAEROBI OBBLIGATI o STRETTI O 2 dannoso o fatale. Inibiti da tensioni di O atmosfera. Fermentano. (Es. Clostridi).

5 AEROBI STRETTI: 2) AEROBI: L O 2 è indispensabile per la loro crescita e funge da accettore finale di e-. Capaci solo di RESPIRAZIONE AEROBIA (Es. micobatteri) AEROBI FACOLTATIVI: O 2 non indispensabile, ma facilita la crescita. Sono i più versatili; cambiano il prprio metabolismo a seconda della presenza o meno di aria. (Es. Enterobacteriaceae) MICROAEROFILI O 2 richiesto, ma in concentrazione inferiore a quella atmosferica. Respirano. CO 2 al 5-10% facilita la loro crescita. (Es. Campylobacter)

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7 COLTIVAZIONE DEI BATTERI COLTIVAZIONE DEI BATTERI: processo mediante il quale si cerca di ottenere la riproduzione dei microrganismi in un ambiente artificiale fornendo loro le sostanze nutritizie necessarie e adatte condizioni ambientali: - Temperatura - Acidità (ph) - Pressione osmotica - Luce ecc. TERRENI DI COLTURA: mezzi artificiali contenenti tutti gli elementi nutritizi necessari per coltivare i batteri. La coltivazione dei batteri ci permette di: - studiarne le caratteristiche biologiche - isolarli ed identificarli da un campione biologico a scopo diagnostico..(microbiologia medica) PREPARAZIONE DEI TERRENI DI COLTURA - Pesata dei vari costituenti - Dissoluzione in H 2 O - Sterilizzazione (in autoclave o tramite filtrazione)

8 SUDDIVISIONE DEI TERRENI DI COLTURA PER BATTERI A) In base allo stato fisico 1) TERRENI LIQUIDI 2) TERRENI SOLIDI C) In base alla funzione 1) TERRENI SELETTIVI 2)TERRENI DISCRIMINATIVI 3) TERRENI (COLTURE) DI ARRICCHIMENTO B) In base alla composizione chimica 1) TERRENI MINIMI: contengono in composizione nota solo sali inorganici; 2) TERRENI SINTETICI: contengono in composizione nota sia composti organici che inorganici; 3) TERRENI COMPLESSI (RICCHI): ricchi di substrati organici di cui non tutti i componenti sono noti (estratto di lievito, di organo). Usati per l isolamento di germi esigenti

9 A) In base allo stato fisico 1) TERRENI LIQUIDI Sono di consistenza liquida Sono limpidi, se sterili; evidenziano la crescita batterica tramite intorbidimento ES: BRODO NUTRIENTE, infuso di cuore e cervello (terreno molto ricco) Impiego: Studiare in vitro la crescita batterica; Favorire la crescita dei batteri in un campione clinico (arricchimento)

10 2) TERRENI SOLIDI La consistenza solida è ottenuta tramite l aggiunta di AGAR (polisaccaride, inerte estratto da alghe marine; 70%agarosio, 30% agaropectina) ES: AGAR SANGUE, AGAR SALE MANNITE, AGAR McCONKEY ecc. Impiego: permettono l isolamento in COLTURA PURA permettono di OSSERVARE LA MORFOLOGIA DELLE COLONIE Ultima zona di semina: colonie isolate Prima zona di semina: crescita confluente

11 C) In base alla funzione 1) TERRENI SELETTIVI: sono terreni di crescita adatti alla moltiplicazione di uno specifico microrganismo o di un numero ristretto di microrganismi che sfavoriscono la crescita di altri microrganismi. ESEMPI: campione clinico polimicrobico FECI, TAMPONE FARINGEO, TAMPONE CUTANEO ecc. il terreno selettivo sfavorisce la crescita dei batteri che non voglio isolare AGAR SALE MANNITE: contiene il 7.5% di NaCl che inibisce la maggior parte dei Gram-; terreno selettivo per l isolamento degli Stafilococchi; AGAR MacCONKEY: contiene sali biliari che inibiscono la maggior parte dei Gram+; terreno selettivo per l isolamento degli enterobatteri; AGAR THAYER MARTIN: terreno selettivo per l isolamento delle neisserie patogene. Contiene antibiotici ed antifungini verso cui le neisserie patogene non sono sensibili.

12 2) TERRENI DISCRIMINATIVI: rendono possibile alle colonie di un dato germe di svilupparsi assumendo un aspetto tale da essere riconosciuto a prima vista. ESEMPI: AGAR SALE MANNITE: contiene la MANNITE come unica fonte di carbonio; permette di discriminare gli Stafilococchi patogeni (S. aureus) nell ambito degli Stafilococchi; Colonie acidificanti (gialle): la fermentazione del mannitolo produce acidi che fanno virare il colore dell indicatore verso la forma acida. ES: S. aureus Colonie incolori: il germe non fermenta il mannitolo; le colonie rimangono del colore del terreno ES: S. epidermidis

13 2) TERRENI DISCRIMINATIVI: rendono possibile alle colonie di un dato germe di svilupparsi assumendo un aspetto tale da essere riconosciuto a prima vista. ESEMPI: AGAR MacCONKEY: contiene il LATTOSIO come unica fonte di carbonio; permette di discriminare gli enterobatteri patogeni (S. typhi) nell ambito degli enterobatteri. Colonie acidificanti (rosse): la fermentazione del lattosio produce acidi che fanno virare il colore dell indicatore verso la forma acida. ES: E. Coli Colonie incolori: il germe non fermenta il lattosio; le colonie rimangono del colore del terreno ES: S. typhi

14 3) TERRENI (COLTURE) DI ARRICCHIMENTO: sono terreni selettivi liquidi. La presenza di particolari sostanze o di particolari condizioni fisiche favorisce la crescita in numero delle specie da arricchire, mentre allunga la fase di latenza delle specie competitrici. ESEMPIO: TERRENO AL SELENITO per l isolamento delle Salmonelle dalle feci Numero di batteri 6-8 ore Tempo (ore) Batterio patogeno che voglio isolare dalle feci (es: Salmonella typhi) Batteri non patogeni commensali intestinali

15 LA COLTIVAZIONE DEI GERMI ANAEROBI Varie procedure a seconda della sensibilità all O 2 : 1) Chiusura ermetica delle provette o aggiunta di olio di vasellina; 2) Aggiunta al terreno di agenti riducenti (es: Tioglicollato) che riducono l O 2 ad H 2 O; 3) Giara per anaerobiosi All interno del contenitore, accanto alle piastre, viene sistemata una busta contenente composti per lo sviluppo di H 2 (boroioduro di sodio) e di CO 2 (acido citrico e sodio bicarbonato). I composti vengono attivati mediante l aggiunta di 10 ml di acqua. Nella busta è presente anche un catalizzatore che permette la combinazione dell O 2 contenuto nel recipiente con l H 2 liberato e la formazione di H 2 O 4) Cabina anaerobica L atmosfera all interno della cabina contiene: 85% N 2 ; 10% H 2 ; 5% CO 2

16 LA RIPRODUZIONE E LA CRESCITA DEI BATTERI

17 I BATTERI SI RIPRODUCONO PER SCISSIONE BINARIA. In questo processo si verifica: La duplicazione del cromosoma...batterico; L allungamento della cellula batterica; La formazione di un setto trasverso in posizione centrale; La suddivisione di una copia del...cromosoma e del citoplasma...nelle due cellule figlie. La SCISSIONE BINARIA SCISSIONE BINARIA è un processo di riproduzione asessuata. I batteri non si riproducono sessualmente sebbene sia possibile un processo di scambio di informazione genetiche tra due cellule batteriche differenti descritto come una forma di sessualità.

18 In seguito a scissione binaria si verifica un aumento del numero degli individui con costituzione di una COLTURA BATTERICA o POPOLAZIONE Studiare la CRESCITA BATTERICA CRESCITA BATTERICA significa analizzare come il numero degli individui in una popolazione varia rispetto al tempo

19 METODI DI CONTA DEI BATTERI Per seguire l andamento della crescita batterica è necessario eseguire delle misurazioni quantitative. 1) CONTA TOTALE: valuta il numero totale di cellule batteriche sia quelle vive che quelle morte a) Conta al microscopio: Viene utilizzata una camera di conta in cui è noto il volume di ogni riquadro

20 b) Impiego di contatori elettronici: Strumenti automatici che misurano la conducibilità elettrica di una sospensione di cellule batteriche c) Misurazione della densità ottica allo spettrofotometro: In seguito alla crescita si verifica un intorbidimento del mezzo di coltura che può essere valutato quantitativamente con l ausilio di uno spettrofotometro

21 2) CONTA VITALE: valuta il numero di cellule batteriche VITALI cioè in grado di dividersi e dare origine a due cellule figlie e, successivamente, a colonie batteriche. CFU: unità formanti colonie

22 LA CURVA DI CRESCITA Per seguire la crescita di una coltura batterica rispetto al tempo si impiegano TERRENI LIQUIDI come ad esempio un brodo nutriente 1) FASE DI LATENZA Rappresenta la fase di adattamento dei microrganismi al mezzo di coltura (sintesi di tutti i fattori, proteine, enzimi necessari per l approvigionamento di sostenze nutritizie presenti nel mezzo di coltura). La velocità di crescita è zero. Il numero dei batteri è costante rispetto al tempo; 2) FASE ESPONENZIALE È la fase di crescita in cui i batteri si accrescono alla massima velocità possibile. Il numero dei batteri raddoppia ad intervalli regolari di tempo. La velocità di crescita è costante; 3) FASE STAZIONARIA La mancanza di nutrienti e l accumulo dei metaboliti tossici rallentano la crescita dei batteri fino ad azzerarla. La velocità di crescita è zero. Il numero dei batteri è costante rispetto al tempo; 4) FASE DI LETALITÀ O DI MORTE I batteri muoiono con una cinetica esponenziale. Il numero dei batteri dimezza ad intervalli regolari di tempo. La coltura va incontro ad autosterilizzazione.

23 FATTORI CHE INFLUENZANO LA PRESENZA E LA DURATA DI ALCUNE FASI DI CRESCITA FASE DI LATENZA: Non sempre è presente La sua presenza è influenzata da vari fattori quali ad esempio: 1) Stato fisiologico delle cellule 2) Natura del terreno in cui le cellule vengono inoculate 3) Modalità di inoculo Cellule batteriche provenienti da una fase ESPONENZIALE di crescita inoculate in un terreno di identica composozione chimica Cellule batteriche provenienti da una fase STAZIONARIA di crescita inoculate in un terreno di identica composizione chimica NO LATENZA SI LATENZA

24 Inoculi abbondanti riducono la fase di latenza Inoculi diluiti allungano la fase di latenza

25 FASE ESPONENZIALE Diversi fattori possono influenzare la velocità di crescita di una coltura batterica ed il TEMPO DI GENERAZIONE: tempo che intercorre tra due generazioni successive 1) FATTORI GENETICI Velocità di crescita di alcuni batteri alle loro T ottimali Organismi Temp. C Tempo di generazione in ore Bacillus stearothermophilus 60 0,18 Escherichia coli 40 0,35 Bacillus subtilis 40 0,43 Vibrio marinum 15 1,35 Mycobacterium tuberculosis 37 c.a.24

26 2) FATTORI AMBIENTALI Sostanze nutritizie Temperatura PH Aereazione Forza ionica CLASSIFICAZIONE DEI BATTERI A SECONDA DELLA TEMPERATURA OTTIMALE DI CRESCITA TERMOFILI: C MESOFILI: C PSICROFILI: C Velocità di crescita Effetto della T sulla velocità di crescita di E. coli, un tipico mesofilo Temperatura ( C)

27 SCHEMA DI CHEMOSTATO PER ALLESTIMENTO DI COLTURE CONTINUE

28 Buona Pasqua

29 STERILIZZAZIONE