Tecniche di sterilizzazione

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1 Tecniche di sterilizzazione La sterilizzazione è un processo il cui scopo è quello di stabilire condizioni asettiche, mediante rimozione di tutti i microrganismi. La sterilizzazione è molto importante nella ricerca algologica, specialmente nel mantenimento dei ceppi isolati in coltura.

2 Tecniche di sterilizzazione

3 Inoltre l uso di tecniche di sterilizzazione minimizza la contaminazione, e consente di condurre esperimenti in modo più preciso. Le tecniche di sterilizzazione non sono difficili, ma richiedono molta cura. I materiali sterilizzati esposti all ambiente si contaminano rapidamente, a causa dei milioni di spore presenti nell aria.

4 Il termine disinfettare viene spesso confuso con sterilizzare. Disinfettare vuol dire operare per uccidere tutti o gran parte dei microrganismi patogeni presenti in un ambiente o in una superficie. Per esempio, lavarsi le mani e pulire le superfici con detergenti tipo etanolo al 70% prima di maneggiare colture sterili è una procedura di disinfezione che fa parte delle tecniche di sterilizzazione, ma non le esaurisce.

5 I metodi di sterilizzazione invece prevedono l eliminazione di qualsiasi microrganismo. Possiamo dividerli in 4 categorie: - a caldo; - mediante onde elettromagnetiche; - per filtrazione; - con reagenti chimici

6 La sterilizzazione a caldo è la più usata. Richiede temperature 100 C; Essa richiede inoltre che i materiali da sterilizzare siano termoresistenti (es. vetreria, strumenti metallici,fogli di alluminio)

7 Le sostanze liquide possono essere sterilizzate mediante filtrazione, quando in soluzione siamo presenti sostanze termolabili. Es. componenti organici tipo vitamine.

8 Le onde elettromagnetiche (raggi ultravioletti [UV], raggi gamma, raggi x, e microonde)sono usate come alternativa per i materiali solidi che non possono essere esposti ad alte temperature (es. prodotti in plastica).

9 Infine, molti tipi di sostanze chimiche possono essere usate per la sterilizzazione. Bisogna comunque considerare che tracce di queste sostanze possono rimanere nei recipienti, interagendo negativamente con gli organismi. Per questo motivo, oggi queste procedure sono usate molto di rado.

10 Tecniche di sterilizzazione a caldo

11 autoclave L autoclave è la macchina più efficace per effettuare la sterilizzazione a caldo. E un apparato consistente in una camera d acciaio, chiusa ermeticamente al cui interno del vapore sotto pressione produce temperature di 121 senza che i liquidi vadano in ebollizione. 10 minuti di autoclave a 121 C bastano per sterilizzare provette di 18 mm di diametro, mentre 1 ora è richiesta per sterilizzare contenitori di 10 l.

12 Un modello di autoclave

13 Alcune precauzioni sono fondamentali per effettuare con successo una sterilizzazione con autoclave Per i liquidi è importante lasciare uno spazio libero nel contenitore. Inoltre il tappo dovrebbe essere chiuso non ermeticamente, per evitare che la pressione salga troppo. Dopo essere passati in autoclave alcuni materiali sono ancora umidi, soprattutto i materiali tipo cotone o carta. In questo caso una successiva sterilizzazione a secco (150 C per almeno un ora) è consigliata.

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17 Sterilizzazione tramite stufa Per le sterilizzazioni a secco si usane generalmente le stufe. Perché sia efficace le temperature devono essere più alte e i tempi più lunghi di quanto non sia richiesto quando si usi l autoclave. Il modo più rigoroso richiederebbe 250 C per 3-5 ore; nella pratica di solito basta riscaldare a 150 C per 3 o 4 ore.

18 Tecniche di sterilizzazione tramite filtrazione

19 La Sterilizzazione mediante filtrazione è richiesta per componenti termolabili. E un metodo rapido, se deve essere sterilizzato un piccolo volume di liquido. Esiste in commercio una grande varietà di filtri, a differente porosità, fatti di materiali diversi e di differenti dimensioni. In genere i filtri possono essere autoclavati ed hanno portosità minore di 0.2 mm; soltanto i virus sono più piccoli e possono passare. Se la soluzione è viscosa o contiene particelle in sospensione, conviene effettuare prefiltrazione con un filtro dai pori di 1mm di diametro.

20 Tecniche di sterilizzazione tramite onde elettromagnetiche

21 Sterlilizzazione tramite UV La sterilizzazione con raggi X o Gamma, si realizza a livello industriale e non viene applicata in laboratorio, per ragioni di sicurezza. La radiazione UV può essere usata in laboratorio per sterilizzare piccoli ambienti, quando non ci sia nessuno all interno(es. cappe a filtro laminare, banchi di laboratorio). La radiazione UV è efficace soprattutto a 260 nm, causando la formazione di legami covalenti tra timine adiacenti nel DNA. Questi dimeri causano errori di replicazione del DNA, provocando mutazioni letali.

22 Una lampada UV produce radiazioni con lunghezza d onda tra 240 and 280 nm. L energia varia con il bulbo, e va da 40 a microwatt/s.cm 2. La scelta del bulbo dipende dallo scopo. Bulbi a base energie sono usati per sterilizzare cappe e banchi, mentre quelli ad elevata energia servono per sterilizzare l acqua. I raggi UV non attraversano il vetro. Per sterilizzare i liquidi ci vorrà un bulbo ad immersione.

23 La sterilizazione con il forno a microonde è la più rapida. L effetto prodotto dalle microonde è di due tipi: le microonde possono uccidere direttamente le cellule o indirettamente, facendo innalzare la temperatura dei liquidi fino all ebollizione. Si raccomanda l uso di un microonde con un tavolo girevole e con una potenza di 700 watt.

24 Tecniche di sterilizzazione tramite composti chimici

25 Sterilizzazione tramite ipoclorito di sodio La sterilizzazione con sodio ipoclorito è molto usata in acquacultura, le cui pratiche richiedono sterilizzazione di ampi volumi di liquidi. L applicazione di questa tecnica può non essere sufficiente per uccidere le forme di resistenza di taluni microganismi (cisti). Generalmente il trattamento prevede l uso di 1-5 ml di sodio ipoclorito per litro di acqua. Durante il trattamento le acque non vanno agitate. Il trattamento dovrebbe durare alcune ore, altrimenti si devono usare concentrazioni maggiori della sostanza. Ler soluzioni non devono essere esposte alla luce del sole durante il trattamento. A fine trattamento il sodio ipoclorito viene neutralizzato con l aggiunta di sodio tiosolfato (Na 2 S 2 O 3 5H 2 O). Generalmente si aggiunge 1 ml di sodio tiosolfato per 4 ml di sodio ipoclorito

26 Camere a flusso laminare Una camera a flusso laminare posta in una piccola stanza chiusa è la scelta migliore per maneggiare il materiale e le culture sterili. Di solito sono attrezzate con una lampada UV, per sterilizzare l ambiente quando non è in uso, e con un bruciatore Bunsen. Nella zona di lavoro la circolazione dell aria dovrebbe essere ridotta al massimo e l operatore dovrebbe muoversi il meno possibile e molto lentamente.

27 Sterilizzazione di terreni solidi Come per i terreni di coltura liquidi, la sterilizzazione si effettua autoclavando a 121 C per 15 minuti. Gli slants nelle provette devono essere riscaldati tenendoli inclinati, in modo che l agar si solidifichi formando una superficie in pendenza vicino all estremità della provetta. Questo faciliterà le operazioni di trasferimento del campione algale. Quando si usano piastre Petri, il terreno agarizzato va versato in Piastre sterili e sotto cappa a flusso laminare. Per ridurre la contaminazione l agar non deve riempire più della meta della piastra Eventuali componenti termolabili vanno aggiunti prima che l agar solidifichi (50-60 C), sterilizzandoli a freddo.